非线性成像技术是一种行之有效的工具，其通过提供独特的数据来帮助生物学家将特定的分子活动与细胞乃至整个生物体的功能和结构紧密联系起来。目前有两大主要发展趋势影响着可调谐超快激光器的设计，以实现在衍射极限或近衍射极限情况下的非线性显微成像：第一是需要更长的波长来实现更深度的成像和更少的光损伤；第二是使用更加灵活的系统来支持多模式成像。同时，系统灵活性不但能减少实验的建立时间，而且还能令激光器的价值最大化。

　　更宽的调谐范围和更长的激发波长

　　非线性成像能够受益于超快激光光源更宽的调谐范围，尤其是在长波长区域。更宽的调谐范围能够支持荧光体-染料、指示剂和荧光蛋白的样品需求，这些样品在尖端生物学领域的应用不断增加。此外，对于二次谐波和三次谐波成像而言，更宽的调谐范围能够使这些成像技术工作在一个更加合适的波段，而这一波段正好能够与其他实验参数和限制相匹配。最为重要的是，扩展超快显微镜激光器的调谐范围到更长波长，使得对更深层次组织的成像成为可能（见图1）。

　　图1：更长的波长实现更深层次的组织成像。图中小鼠脑部毛细血管的MPE照片，是利用AlexaFluor568和相干公司的ChameleonVisionII激光器实现的双光子激发成像。

之所以能够在更深层次的组织中成像，是因为生物样品的光散射大部分是米氏散射，正比于1/λ4。因此，即使激发波长有一个很小的增加（如几十个纳米），也会导致散射部分极大的减少，这已被证明是在深组织成像中限制信噪比的一个重要因素。

　　使用更长波长同样能减少光损伤。例如，曾有研究人员证实，在大多数植物标本上通过紧聚焦，可以使用平均输出功率超过100mW的1280nm激光束安全地观察到持续的多光子光谱。在同一项研究中，研究人员还发现当使用波长830nm、平均功率大于10mW的钛宝石激光束紧聚焦照射样品时，通常在一秒钟之内就会观察到由多光子吸收激发引起的破坏性等离子体的形成。在一项胚胎研究中[2]，研究人员指出：“ 很明显，使用800nm和1250nm高强度光激发有显著的不同。较长波长对胚胎的损伤更小，可以认为是安全辐射。”因此，较长波长同样实现了高功率激光的安全使用，这反过来又促进了最大可能的成像深度。

　　灵活的波长调谐实现多模式成像

　　目前有各种各样的非线性激发技术，每一种都适于对不同种类的生物分子和微结构进行成像。例如，相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）通常是通过在2840cm-1附近激发它们的CH延展振动、从而为脂类成像提供最佳方法。另一方面，多光子激发（MPE）是用于激发荧光蛋白、传统染色剂和内源性荧光样品荧光的理想方式。而二次谐波和三次谐波技术最适用于膜、胶原蛋白和肌纤维，同样也能用于一些脂类。因此，研究人员经常想在同一个样品上同时使用这几种不同的方法（见图2），或者利用两个不同波长进行多光子激发（MPE）。这被称作多模式成像，理想的激发光源需要有两个独立可调谐的输出波长。

　　图2：多模式成像案例--伪彩色果蝇幼虫全身成像。红色是无标记CARS信号，绿色是双光子荧光信号。

满足显微镜成像的需求

　　为了满足长波长激发的需求，首先要扩展自动钛宝石激光器的调谐范围。具体来说，当输出波长超过1000nm时，钛宝石的增益便会逐步下降。然而，调谐范围是可以通过减少损耗和增加泵浦功率来扩展的。例如，相干公司最新的ChameleonVision系列激光器使用的宽带光学元件具有极低的散射和吸收，配合使用相干公司独特的18W、532nm泵浦激光器，实现了波长范围680~1080nm的一键式调谐。

　　随着紧凑型光学参量振荡器的不断发展，如相干公司的ChameleonCompactOPO，人们对使用波长大于1080nm激光的兴趣也在不断增加。通过使用集成式控制器即可轻松将波长调谐至1600nm，操作非常简便。此外，使用可选的fan-poledOPO晶体，可以让钛宝石激光器和OPO在不改变光束指向的条件下实现独立调谐，这对于多模式成像是非常理想的。现在又增加了一个将OPO输出倍频得到可见光的选项，进一步增加了多模式成像的选择（见图3）。

　　图3：Fan-poled晶体的使用，使得钛宝石振荡器与OPO能够实现独立的大范围波长调谐。OPO的输出倍频进一步扩展了多模式成像能力。图中显示了荧光体与成像技术是如何通过多模式成像来相互匹配的。蓝色线条代表了频率间隔为2840cm-1的脂类CARS成像。

　　非线性或多光子成像是超快激光器的重要应用之一。激光器制造商正在从操作的简便性、调谐范围和系统灵活性这几个方面不断改进超快激光器产品，进一步支持该领域的发展。