2025年7月21日，《ACS Central Science》杂志在线发表了华中科技大学武汉光电国家研究中心张玉慧教授团队题为 Illuminating Mitochondrial Dynamics: Ultrahigh Labeling Stability Probe for Long-Term SIM Super-Resolution Imaging of Mitochondria 的研究论文。该研究系统性评估了高反应活性基团与Cy3在线粒体共价标记中的兼容性，设计、合成并筛选得到一种新型线粒体共价探针HZ Mito Red。该探针具备超高标记稳定性、良好抗光漂白能力和较低的光毒性，有效解决了传统线粒体探针因标记稳定性差而在长时程成像中易产生脱靶干扰的问题。利用该探针，研究团队实现了在铁死亡、凋亡和自噬过程中线粒体的超分辨动态长时程成像，为研究线粒体在病理状态下的超微结构和动力学变化提供了一种强有力的新工具。

线粒体动态变化与癌症、神经退行性疾病等多种疾病密切相关，对其超微结构动态变化的长时程检测有助于深入理解相关疾病的机制。然而，现有的线粒体有机荧光探针在长时程超分辨动态成像中存在标记稳定性差、易光漂白等问题并成为实现线粒体精细结构长时程监测的关键瓶颈。针对这些问题，张玉慧教授团队开展了系统研究，设计、合成并筛选了八种候选化合物，最终成功开发出适用于结构光照明显微镜（SIM）长时程动态超分辨成像的新型红色共价线粒体荧光探针HZ Mito Red（图1）。该探针不仅满足活细胞超分辨长时程动态成像需求，还兼容免疫荧光染色。

图1. HZ Mito Red/ HZ Mito Deep Red标记线粒体示意图

HZ Mito Red利用氯乙酰胺基团实现对线粒体的共价标记，克服了以往线粒体探针对膜电位的依赖性，从而减少了非特异性标记带来的背景信号。这种共价标记策略显著提高了探针的标记稳定性。相比于比商用线粒体探针Mito Tracker Red（MTR），HZ Mito Red在标记稳定性上有约10倍的提升，使其在SIM长时程动态成像中具有出色的信噪比（图2）。此外，该探针的抗光漂白性能较MTR也提高了近3倍，在连续采集300帧SIM图像后仍保留约80%的荧光亮度。同时，HZ Mito Red的光毒性显著低于MTR，在连续400帧成像后细胞线粒体形态仍保持完整。这些特性使得HZ Mito Red能够在关键细胞过程（如铁死亡、凋亡和自噬）中实现无伪影、高信噪比、长时程的超分辨SIM动态成像，为精准解析线粒体在病理条件下的形态变化提供了强有力的工具。

图2 不同探针在长时程动态线粒体超分辨率成像中的性能比较

此外，团队还开发了深红色线粒体探针HZ Mito Deep Red。该探针同样具备较高的标记稳定性和低光毒性，适用于长时程超分辨动态追踪。在连续300帧SIM成像后仍保留了60%的荧光强度，且几乎不产生光毒性。此外，HZ Mito Red和HZ Mito Deep Red均能与免疫染色高度兼容（图3），可用于不同亚细胞结构的多色标记。这也是首对同时能兼容活细胞超分辨动态成像和固定细胞免疫荧光染色的有机荧光探针。综上所述，HZ Mito Red和HZ Mito Deep Red为深入研究线粒体在各类复杂的生理和病理过程中的动态变化提供了有力的新工具。

图3 HZ Mito Red和HZ Mito Deep Red与免疫标记相结合的多色超分辨率成像

华中科技大学武汉光电国家研究中心张玉慧教授与博士后张朦为论文的共同通讯作者，博士生吝香朋、庞雪蕾与硕士生黄悦为共同第一作者，博士生段欣欣、魏云飞、景宁为共同作者。该研究得到国家重点研发计划（2022YFC3401100）、国家自然科学基金（92354305、32271428、32201132）、中国博士后科学基金（BX20220125、2022M711257）、华中科技大学交叉研究计划（2023JCY5045）以及武汉光电国家研究中心主任基金的资助。

论文链接：https://doi.org/10.1021/acscentsci.5c00695