8月14日，《光:科学与应用》（Light: Science & Applications）刊发华中科技大学武汉光电国家研究中心张玉慧教授团队最新研究成果。该论文题为 “Simple and efficient delivery of cell-impermeable organic fluorescent probes into live cells for live-cell superresolution imaging” （一种简单有效将不透膜有机荧光探针运送到活细胞内用于活细胞超分辨成像的新策略）。

超分辨成像技术是二十一世纪发展最为迅速的研究领域之一。在超分辨成像过程中成像系统和荧光标记物对于最后成像效果都具有至关重要的作用。目前主流的荧光标记物主要分为有机荧光染料和荧光蛋白。基于有机荧光染料构建的有机荧光探针相对于荧光蛋白具有荧光量子产率高、抗光漂白能力强、分子尺寸小和易于改造等诸多优势。但由于目前商业化的大多数性能优秀的荧光染料（例如Alexa、Atto系列）都因无法透过活细胞的细胞膜而不能用于活细胞标记，所以有机荧光探针在活细胞超分辨成像领域中的应用受到了极大的限制。而张玉慧教授团队长期致力于攻克不透膜有机荧光探针进入活细胞并标记亚细胞结构这一难题。

2014年张玉慧教授团队率先将细胞穿膜肽（CPPs）引入到有机荧光探针的结构中，实现了对活细胞中微丝、溶酶体等亚细胞结构的超分辨动态成像，相关工作发表于《自然·通讯》（Nature Communications 2014, 5:5573, 1-8及2017, 8:1307, 1-9）。但该技术由于在探针合成中引入了细胞穿膜肽，增加了合成难度，在一定程度上限制了其大范围推广。近日张玉慧教授团队通过对肽型载体的优化、筛选设计出了一种全新的肽型载体PV-1（如图1a），不透膜有机荧光探针通过与PV-1简单共孵育即可进入活细胞内，实现对活细胞内亚细胞结构的标记（如图1b）。这是国际上首次实现不透膜有机荧光探针通过与肽型载体简单共孵育即可进入活细胞内进行亚细胞结构标记，为解决不透膜有机荧光探针进入活细胞提供了全新的研究思路。由于该策略不需要肽型载体和有机荧光探针共价连接，因此不会增加有机荧光探针的合成难度，所以没有深厚有机合成背景的实验室也可以轻松掌握。

研究人员首先展示了通过优化、筛选得到的肽型载体PV-1可以将标记微管的不透膜有机荧光探针投送到活细胞内并实现特异性标记，且该载体具有投送效率高和低毒性的优点并可用于多种细胞（如图1c-g）。

图1 PV-1可以高效投送标记微管的探针进入活细胞内

通过将22种包含不同颜色能标记不同亚细胞结构（包括：细胞核，微丝、微管、线粒体、溶酶体、内质网）的有机荧光探针投送到活细胞内进一步展示了该策略的普适性。研究人员还进一步展示了利用PV-1和多种有机荧光探针共孵育，可以一次性将多种探针投送到活细胞内实现双色或三色荧光标记（如图2）。这对于研究亚细胞结构动态相互作用具有重要意义。

图2 PV-1可以同时将多种不透膜有机荧光探针投送到活细胞内实现多色标记

最后，研究人员利用PV-1将多种高性能有机荧光探针投送到活细胞内，结合结构光照明超分辨显微成像系统实现了对多种亚细胞结构的超分辨动态成像（如图3a-g），并进一步对内质网和溶酶体进行了双色、长时程超分辨动态成像，观察到了超高分辨率的内质网捕获溶酶体的动态过程（如图3h-k），这对于研究内质网和溶酶体的相互作用具有重要意义。

图3 利用结构光照明超分辨显微成像系统对活细胞亚细胞结构进行动态成像

该研究工作得到了国家重点基础研发计划（973计划，No. 2015CB352002）, 国家自然科学基金委员会面上项目（No. 31770924, 61827825, 31600692, 31470056）、国家自然科学基金委员会创新研究群体科学基金（61721092）和武汉光电国家研究中心主任基金的大力支持。张玉慧教授为论文通讯作者，博士研究生张朦，李梅花为并列第一作者，张文婷、韩于冰为共同作者参与相关工作。感谢华中科技大学武汉光电国家研究中心张智红教授、代博雷、华中农业大学农业微生物学国家重点实验室宗琪老师和胡哲博士在实验仪器上的大力支持。

文章链接：https://www.nature.com/articles/s41377-019-0188-0