本文介绍的是天津大学精密仪器与光电子工程学院张鹏飞副教授课题组和广西科学院王桂文研究员课题组在单细胞拉曼光谱分析方面开展的研究工作，发表在《Journal of Innovative Optical Health Sciences》期刊2021年第6期。

Combination of multi-focus Raman spectroscopy and compressive sensing for parallel monitoring of single-cell dynamics

基于多焦点拉曼光谱和压缩感知技术的单细胞动态过程并行化监测方法

Zhenzhen Li, Xiujuan Zhang, Chengui Xiao, Da Chen, Shushi Huang, Pengfei Zhang* and Guiwen Wang*

研究背景

拉曼光谱是一种利用分子振动的指纹特征来对物质进行检测的光谱分析技术。由于具有非接触、无标记以及非侵入式测量等诸多优点，拉曼光谱常与激光光镊、共聚焦显微等技术相结合，用于生物单细胞的成分分析以及单细胞在生长、发育、凋亡等过程中分子组分变化的动态监测。然而，传统的基于单焦点的共聚焦显微拉曼光谱技术用于单细胞动态过程监测时效率十分低下，一次只能分析一个单细胞的行为。然而，即使是同一个细胞种群的单细胞都具有极大的异质性，表现在不同单细胞的分子组分以及对外界环境变化的应急响应的差异性。因此，揭示单细胞异质性背后的分子机制需要对大量单细胞的动态过程进行跟踪监测，使得单焦点拉曼光谱技术难以胜任。

内容简介

本文针对单焦点拉曼光谱用于单细胞动态过程监测时效率低下的问题展开研究，提出了多焦点和压缩感知技术相结合的单细胞拉曼光谱并行化采集方法。该方法利用激光焦点阵列同时激发多个单细胞的拉曼散射，并将它们压缩在同一个光谱采集通道中，继而在压缩感知框架下发展光谱重建算法，准确地解析出各个单细胞在动态生理过程中不同时刻的拉曼光谱，大大提高了单细胞拉曼光谱的分析效率。

图文导读

1.多光镊拉曼光谱

图1：多光镊拉曼光谱系统结构原理图

如图1所示，多光镊拉曼光谱系统采用一对扫描振镜GM1、GM2快速调制激光束的偏转方向。当扫描振镜所施加的扫描电压呈图中所示的阶梯状波形时，被物镜Obj聚焦的激光束在其焦平面上快速跳动，从而以分时复用的方式产生一维或者二维的激光焦点阵列，同时激发位于不同位置的多个单细胞的拉曼散射。为了便于叙述，图中只给出了具有四个焦点的一维聚焦激光点阵的波形。

由多个单细胞后向散射的拉曼光子逆着激发光束的方向返回，经过扫描振镜GM1、GM2后实现退扫描，并在二向色镜DM处与激发光束分离。退扫描的拉曼散射光被另外一对扫描振镜GMx、GMy重新扫描后被透镜L3聚焦于成像光谱的入口处，经光栅衍射分光后记录在光谱采集CCD相机上。GMx上同样施加阶梯状的电压波形（参考图1中的x投影波形），并且与GM1、GM2的波形同步，使得多焦点阵列所激发的单细胞的拉曼光谱沿着x方向等间隔（d个像素点）地排列，并压缩记录在CCD的同一行像素上，形成单个光谱带，实现多个细胞的拉曼光谱的并行化采集。

2.光谱压缩的数学模型

如图1所示，压缩的混合光谱y为4个单细胞的拉曼光谱s₁- s₄沿着水平方向等间隔（d个像素）地平移后叠加而成：

  (1.1)

式中T为平移算符，它将一个光谱平移d个像素点。求解式(1.1)的逆问题即可从叠加的光谱中解析出各个单细胞的拉曼光谱。然而，这是一个严重病态的逆问题，需要一些先验知识作为约束条件。

3.基于协同层次稀疏特征的光谱重建算法

图2：多光镊拉曼光谱技术用于四个单细胞动态监测时光谱信号压缩的协同层次稀疏模型

由于单细胞拉曼光谱中通常只有少数的特征拉曼散射占主导地位，因此论文将单细胞的拉曼光谱做本征谱分解，并将分解系数的稀疏性作为约束条件求解式(1.1)的逆问题。假定待研究的系统可能有m个不同的细胞种群中的单细胞参与，我们可以预先利用单光镊拉曼光谱系统采集每一个种群中若干单细胞的拉曼光谱，对其做主成分分析可以得到一个由m组主成分组成的本征光谱库，任意一个单细胞的拉曼光谱都可以用中的本征光谱线性表示。同时考虑到在光谱压缩时，激光焦点阵列所激发的各个单细胞的拉曼光谱沿着水平方向等间隔地平移后被记录在同一个光谱采集通道中。因此，我们可以将中的本征光谱做同样的平移，将平移后的本征光谱库与一起构成一个更大的本征光谱库。则在多个单细胞动态演化过程中，每一个时刻所采集的叠加光谱y⁽ⁱ⁾均可以用中的本征光谱线性表示，并且表示系数x⁽ⁱ⁾表现出层次稀疏特征，即x⁽ⁱ⁾中只有少数几组（对应4个单细胞有4组）元素不为零（群组稀疏性），且每组中只有少数的几个元素不为零（群内稀疏性），如图2所示。此外，表示系数还具有协同结构特征，即不同时刻采集的叠加光谱具有相同的群组稀疏性。论文综合考虑协同稀疏性和层次稀疏性特征，将所有时刻采集的叠加光谱序列整体优化，求解光谱重建的逆问题，

 (1.2)

其中X和Y分别是将不同时刻的系数向量x和叠加光谱向量y堆叠成的矩阵，如图2所示。在此基础上，论文发展了具有协同层次稀疏特征的光谱重建算法(collaborative hierarchical Lasso, C-HiLasso):

 (1.3)

公式第二项用于群组稀疏性协同最小化，第三项用于群内系数稀疏性最小化。

4.多光镊拉曼光谱技术用于多个细菌芽孢的动态萌发过程监测

图3：多光镊拉曼光谱和压缩感知技术用于四个单细胞动态过程监测。(a)一维激光阵列在30 mMCaDPA溶液中囚禁的四个单细胞的明场显微图像。自上而下分别为一个酵母细胞和三个苏云金芽孢杆菌。(b)四个特征时间点采集的叠加光谱

论文利用一维四焦点拉曼光镊囚禁俘获了4个单细胞，并监测了它们在CaDPA溶液中的动态响应过程，尤其是苏云金芽孢杆菌在外源性CaDPA刺激下的动态萌发过程，继而验证了所提光谱采集方法和光谱重建算法的可行性和准确性。如图3所示，一个酵母细胞和三个苏云金芽孢杆菌被囚禁在30mMCaDPA溶液中，它们的叠加光谱随着时间不断变化，但这些光谱变化究竟来自于哪个单细胞不得而知。

图4：利用C-HiLasso算法重建的四个单细胞在不同时刻的拉曼光谱。(a)酵母细胞在不同时刻重建的拉曼光谱；(b-d)三个苏云金芽孢杆菌在动态萌发过程中不同时刻的拉曼光谱

利用式(1.3)中的C-HiLasso算法重建出的四个单细胞在不同时刻的拉曼光谱如图4所示，与通过y投影模式采集的真实光谱非常吻合，并且重建的光谱信号具有更高的信噪比。同时，我们也将重建结果与没有协同稀疏特征的HiLasso算法的结果进行了比较。如图5所示，利用了协同稀疏特征的C-HiLasso算法重建的结果具有更高的光谱还原度。

图5：C-HiLasso和HiLasso算法的光谱重建结果比较。(a)两种算法重建的酵母细胞在t=6 min时刻的拉曼光谱；(b-d)两种算法重建的三个苏云金芽孢在t=6 min时刻的拉曼光谱。GT：真实光谱；HL： HiLasso算法重建的光谱；CHL：C-HiLasso算法重建的光谱

5.总结

虽然本文只针对一维激光阵列的并行化激发方式和x投影模式展开了讨论，但是由于该系统能够对激发焦点的位置和拉曼散射的投影位置独立地控制，论文所提方法同样适用于随机散落在载玻片上的大量单细胞的拉曼光谱并行化激发。同时，对这些单细胞的拉曼光谱进行投影时还可以分别沿着CCD的水平和垂直两个方向投影，进一步提高光谱采集的并行化程度，进一步提高单细胞拉曼光谱的分析效率。该研究对基于单细胞分析的基础生物学研究以及临床疾病诊断应用均具有重要意义。

通讯作者简介

张鹏飞，天津大学精密仪器与光电子工程学院副教授，博士生导师。长期开展生物光子学研究，兴趣包括：压缩光谱成像、单细胞拉曼光谱、光声成像等。在Optica, Light：Science & Applications, Nature Protocol, Photonics Research, Analytical Chemistry, Optics Letters, Optics Express等期刊发表论文50多篇。长期担任Advanced Science, Optica,ACSphotonics, Photonics Research, Environmental Science & Technology,APLphotonics, Optics Letters, Optics Express等多个期刊审稿人。

王桂文，广西科学院研究员。主要从事基于光学技术的生物单细胞分析。先后主持完成国家、省部级项目10项，发表学术论文80多篇。入选广西“新世纪十百千人才工程”第二层次人选。