本文介绍的是浙江大学匡翠方教授课题组在荧光差分显微成像系统中引入偏振调制模块，在对运动样品成像的过程中实现伪像的减少，论文发表在《Journal of Innovative Optical Health Sciences》期刊2022年第5期。

Fluorescence emission difference microscopy based on polarization modulation

基于偏振调制的荧光差分显微成像系统

Wanjie Dong, Yuran Huang, Zhimin Zhang, Liang Xu, Cuifang Kuang, Xiang Hao, Liangcai Cao and Xu Liu

研究背景

荧光差分显微成像由于其低光强以及对荧光染料要求比较低的优势已经成为一种应用比较广泛的显微成像技术，可广泛应用于荧光样品特别是生物样品的超分辨显微成像。传统的荧光差分显微成像系统通过切换光路或者空间光调制器的调制图案实现激发光斑在实心和空心光斑之间的切换，通常在扫面完成一副图像后切换光斑模式再次进行扫描，由于扫描获得两幅图像的时间差，环境噪声，系统震动以及光源不稳定都可能导致最终获得的荧光差分图像存在误差，特别是对运动样品成像时可能会产生伪像。因此，本文通过引入电光调制器实现激发光斑偏振状态的快速调制，结合空间光调制器实现激发光斑在扫描过程中在实心和空心光斑两种状态之间的快速转换，有效减少两幅图像相同位置获取的时间差从而减少荧光差分显微成像结果的伪像和噪声。

内容简介

本文提出了一种通过偏振调制实现荧光差分显微成像系统的激发光斑在实心和空心两种状态之间转换的方法，调制模块由电光调制器和偏振敏感的空间光调制器组成。首先，偏振方向为垂直偏振的激光经过电光调制器的调制可以实现在水平偏振和垂直偏振两种偏振状态之间的快速转换，并在经过二分之一波片调制后偏振方向旋转90°，然后激光入射到空间光调制器表面的左侧，经过空间光调制器调制后经过两次四分之一波片的调制和一次反射镜的反射，偏振方向旋转90°的光斑入射到空间光调制器表面的右侧。空间光调制器左侧光斑入射位置加载实心光斑调制图案，右侧光斑入射位置加载空心光斑调制图案。偏振敏感的空间光调制器只对水平方向偏振光进行调制，当电光调制器调制激光为垂直偏振光时，激光只被空间光调制器左侧加载调制图案调制为实心光斑，当电光调制器调制激光为水平偏振光时，激光只被空间光调制器右侧加载调制图案调制为空心光斑。通过电光调制器调节激光的偏振方向，就可以在扫描过程中实现激发光斑在实心和空心之间的快速转换。

该方法通过如下实验进行验证：对活U2OS细胞内荧光标记的运动线粒体成像，通过成像结果能够观察到一段时间内线粒体的运动情况，和常规荧光差分显微成像系统的成像结果做对比，证明了该方法得到的实心和空心光斑扫描结果能够更好的重合，在进行差分操作时能够有效减少伪像。

图文导读

1.实验系统构成

图1：基于偏振调制的荧光差分显微成像系统示意图

图1展示了实验系统的工作原理，通过电光调制器实现激发光偏振方向的快速转换，不同偏振方向的激发光经过偏振敏感的空间光调制器调制后获得不同状态的激发光斑。

2.荧光差分显微成像

图2：荧光差分显微成像仿真结果。 (a)垂直方向偏振光光场分布。(b)水平方向偏振光光场分布。 (c)垂直和水平方向偏振光差分计算后的光场分布。 (d) (a)，(b)和(c)的光场横截面分布情况

图 2(a)为经过电光调制器调制后为垂直方向偏振光的激发光在经过空间光调制器调制后的光场分布情况，图2(b)为经过电光调制器调制后为水平方向偏振光的激发光的光场分布情况，图2(c)为垂直和水平方向偏振光经过差分计算后的光场分布情况。

3.对40nm荧光颗粒成像结果

图3：(a)对40nm荧光颗粒的共聚焦成像结果和 (b)荧光差分显微成像结果。 (c)图(a)中白色方框区域的局部放大图和白线标记部分的归一化光强分布曲线。 (d)图(b)中白色方框区域的局部放大图和白线标记部分的归一化光强分布曲线。 (e)图(a)中黄色方框区域的局部放大图和黄线标记部分的归一化光强分布曲线。 (f)图(b)中黄色方框区域的局部放大图和黄线标记部分的归一化光强分布曲线。(g)图(a)的解相关计算结果，和(h)图(b)的解相关计算结果。

在对40nm荧光颗粒进行荧光差分显微成像后，得到的共聚焦以及荧光差分显微成像结果分别如图 3(a)和图3(b)所示。实验结果表明荧光差分显微成像能够分辨共聚焦成像时无法分辨的荧光颗粒，有效提升系统分辨率。通过解相关计算能够得到该系统能够实现约160nm的分辨率，和共聚焦相比有效提升系统分辨率和信噪比。

4.对活细胞线粒体成像结果

图4：活U2OS细胞内荧光标记的运动线粒体的(a)共聚焦成像结果和(b)荧光差分显微成像结果。(c)图(a)中白色方框区域的线粒体结构在一段时间内运动情况的局部放大图。(d)图(b)中白色方框区域的线粒体结构在一段时间内运动情况的局部放大图。(e)图(a)中黄色方框区域的局部放大图和白线标记部分的归一化光强分布曲线。(f)图(b)中黄色方框区域的局部放大图和白线标记部分的归一化光强分布曲线

在对活U2OS细胞内荧光标记的运动线粒体进行荧光差分显微成像后，得到的共聚焦以及荧光差分显微成像结果分别如图 4(a)和图4(b)所示。实验结果表明提出的荧光差分显微成像系统能够应用于对运动样品的实时成像。

分别用常规荧光差分显微成像和基于偏振调制的荧光差分显微成像技术对活U2OS细胞内荧光标记的运动线粒体成像，将获得的实心和空心光斑扫描成像结果组成伪彩色图像，其中实心光斑扫描成像结果占据红色通道，空心光斑扫描成像结果占据绿色通道，实验结果如图5(a)-(b) 所示。

图5：(a)常规荧光差分显微成像和(b)基于偏振调制的荧光差分显微成像技术对活U2OS细胞内荧光标记的运动线粒体的实心和空心光斑扫描成像结果组成的伪彩色图像

和常规荧光差分显微成像结果相比，基于偏振调制的荧光差分显微成像得到的实心和空心光斑扫描结果能够更好的重合，在进行差分计算后能够有效减少伪像的存在。

通讯作者简介

匡翠方，浙江大学光电科学与工程学院，教授，博士生导师。主要从事光学超分辨显微成像方面的研究，以第一/通讯作者发表SCI论文百余篇。主持或参与国家自然基金委重大仪器专项，国家重大仪器专项课题等项目10余项。