本文介绍的是不列颠哥伦比亚大学（University of British Columbia，UBC）曾海山教授课题组对适用于活体皮肤的非线性光学显微技术的综述，发表在《Journal of Innovative Optical Health Sciences》期刊2023年第1期。

Nonlinear optical microscopy for skin in vivo: Basics, development and applications

用于活体皮肤的非线性光学显微技术：基础概念、发展和应用

Jianhua Zhao, Yuan Zhao, Zhenguo Wu, Yunxian Tian and Haishan Zeng

研究背景

多光子显微（multi-photon microscopy, MPM）和相干反斯托克斯拉曼散射（coherent anti-Stokes Raman scattering, CARS）是两种基于非线性光学效应的显微成像技术。MPM成像信息来自双光子激发荧光（two-photon excitationfuorescence, TPF）和二次谐波产生（second harmonic generation, SHG），CARS成像信息来自分子振动，两者可以提供补充性信息。组合MPM和CARS技术进行生物医学成像在无创检测应用领域具有极大的潜力，已在正常皮肤评估、皮肤癌和皮肤疾病诊断上得到了广泛的应用。自MPM和CARS显微技术问世以来，成像速度、视场角和成像深度都有很大提升，仪器设备也向便携式、紧凑型、小型化发展，具有视频成像速度和深度成像能力的活体皮肤临床检测设备将触手可及。

内容简介

本文详细介绍了MPM和CARS两种非线性光学显微成像技术在活体皮肤评估和诊断中的发展和应用，主要包括MPM和CARS技术原理介绍和优势对比，活体应用的MPM和CARS成像系统结构与特性介绍，基于MPM和CARS技术的正常皮肤评估，基于MPM和CARS技术的皮肤癌和皮肤疾病诊断，MPM技术在皮肤疾病干预与治疗中的应用，即成像引导的双光子光热效应。

图文导读

1.MPM/CARS系统

图1：典型的退扫描和非退扫描的MPM/CARS系统示意图。在退扫描MPM/CARS系统中，探测器被放置在扫描仪后方，扫描过程中检测器上的信号光束位置不会移动。在非退扫描的MPM/CARS系统中，探测器被放置在物镜的正后方，探测器上的信号光束位置随扫描过程移动。非退扫描MPM/CARS系统需要大面积探测器。透镜组用于扩大扫描光束，使该光束过度填充物镜孔径光阑，以充分利用物镜的数值孔径。两个二色镜用于分离激发光束和信号光束

MPM和CARS系统都是基于共聚焦显微系统的结构进行设计的，具有类似的系统配置、不同的激光源和光学滤波元件。因此，MPM和CARS系统可以组合成一个单一的多模态系统。这样的系统已经被用于正常皮肤、病变皮肤和体内癌变皮肤的成像。

2.正常皮肤评估

图2：25岁的亚洲女性活体前臂皮肤的TPF图像，深度从（a）近表面到（f）近真皮/表皮边界不断增加。

活体皮肤的TPF和SHG的特征与离体大块组织相似，但图像质量不如体外。使用基于共振扫描仪的视频速率MPM系统在740nm激发下的活体前臂背部皮肤（80MHz, 150fs, FOV 200μm*200μm）对活体皮肤成像如图所示。没有观察到细胞核的TPF信号，而细胞质显示出TPF信号强度较高。细胞大小随着深度的增加而减少，从深度25-30μm处直径约为15-20μm到深度40-50μm处直径约为8-10μm。真皮层的双光子成像与其他皮肤层不同，其中结缔结构来自弹性纤维的TPF信号和胶原纤维的SHG信号。与离体研究相似，活体测量证实表皮没有SHG信号。

3.双光子光热效应

图3：（a）传统光热效应和双光子光热效应的比较。传统光热效应没有空间选择性，当激光束通过时，周围的组织会发生改变。双光子光热效应具有空间选择性，当激光束通过时，周围组织不会发生改变。（b）成像引导的双光子光热效应的系统示意图。成像路径（绿色显示）用于通过实时成像引导定位治疗目标，而治疗路径（红色显示）用于聚焦飞秒激光束进行双光子光热效应。

传统的光热效应中，吸收过程没有空间选择性，当激光束经过周围组织时，目标组织和周围组织的结构都会发生改变。而对于双光子吸收的光热效应，由于非线性双光子吸收效应具有空间选择性，只有目标组织被改变。对于相同的目标色团，双光子光热效应的激光波长与传统的光热效应不同，因此双光子光热效应可以防止激光束穿过周围组织时产生的副作用。

4.基于空间选择性光热效应的不同激光治疗策略比较

图4：不同激光治疗策略下基于双光子吸收的空间选择性光热效应：（a）用单次飞秒脉冲（80MHz，150fs）治疗10s；（b）用100次飞秒脉冲治疗10s，每次0.1s，每次间隔0.2s；（c）用100次治疗10s，每次0.1s，每次间隔4.1s。目标区域为50μm×50μm。位于XY图像的中心，在组织表面下40μm处。波长：800nm。激光强度：200mW。比例尺：50μm.

通过不同的策略可以很好地控制治疗效果，同时保持治疗后目标区域周围组织的完整性。

课题组近期已使用小鼠耳朵模型成功证明了这种基于双光子吸收的空间选择性光热效应技术的有效性，可以应用于单一血管或单一病变位置，对血管疾病进行无创的精确微手术。这种微手术方法不仅适用于皮肤，对复杂器官的疾病治疗也有一定的应用潜力，如眼睛（无创治疗）或大脑，其中高空间选择性对防止视觉或中枢神经系统功能的连带影响至关重要。

通讯作者简介

曾海山，加拿大不列颠哥伦比亚大学（University of British Columbia,UBC）皮肤病学与皮肤科学教授，物理学院与医学院兼职教授。主要研究用于早期癌症检测的光疗、光学成像和光谱学技术。已在国际权威刊物发表160多篇学术论文，拥有28项发明专利。他研制的实时荧光内窥镜检查成像系统在国际上首次通过美国FDA认证，已在世界各地150多家医院进行临床使用。最新的无创拉曼光谱皮肤癌检测仪Verisante Aura™于2013年2月被国际光学和光子学学会（International Society for Optics and Photonics, SPIE）授予“棱镜奖”。