前言

本文介绍的是南开大学物理科学学院潘雷霆教授课题组利用光刻图案化技术调控细胞微丝骨架的研究文章，发表在《Journal of Innovative Optical Health Sciences》期刊2023年第16期。

Regulation of actin cytoskeleton via photolithographic micropatterning

光刻图案化技术调控细胞微丝骨架

Fulin Xing, Haimei Zhang, Mengyu Li, Hao Dong, Xuehe Ma, Shiyu Deng,

Fen Hu, Imshik Lee, Leiting Pan*,Jingjun Xu

研究背景

光刻图案化技术（photolithographic micropatterning）源于半导体工业，该技术利用紫外光将掩膜板上的几何图案转移到基底上，再结合后续表面化学修饰手段，使细胞粘附于设计好的图案化细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）上，形成特定形状和空间排布。光刻图案化技术以其简易的工艺流程和较高的精确度，标准化操控细胞生长的微环境，在细胞生物学等领域获得了广泛的应用。细胞骨架（cytoskeleton）是细胞中的蛋白纤维网络体系，包括微丝（microfilament），微管（microtubule）和中间纤维（intermediatefilament）。其中，微丝由肌动蛋白（actin）单体聚合而成，具有极高的动态性，在细胞迁移、细胞分裂、胞内物质运输等多种细胞生理过程中发挥至关重要的作用。微丝骨架作为控制细胞形状和细胞命运的重要因素，目前已经成为细胞图案化技术调控的主要靶点之一。

内容简介

本文利用光刻图案化技术构建了不同形状和尺寸的ECM，以NIH3T3细胞为主要研究对象，探究了不同的力学环境对于细胞微丝骨架的调控作用。此外还探究了不同种类细胞受到ECM几何形状调控时的微丝骨架分布。这些研究对于理解细胞外微环境对于细胞微丝骨架的调控机制具有重要意义。

图文导读

1.ECM几何形状调控微丝骨架的分布与结构

本文基于光刻技术，构建了以聚乙二醇（PEG）抗拒细胞黏附区域和纤连蛋白（Fibronectin，FN）促进细胞黏附区域相交错的图案，实现了单细胞的精确形状控制（图1）。

图1：光刻图案化流程及效果图。（a）光刻图案化工艺流程。（b）NIH3T3细胞图案化控制为矩形、三角形和圆形

为探究ECM几何形状如何调控微丝骨架，设计了边长为50μm的三角形及其衍生的图形，包括T形和V形。NIH3T3细胞在这三种图案上均呈现出相似的三角形包络形态。但是进一步微丝骨架免疫荧光染色结果表明，三角型图案上的细胞微丝肌动蛋白集中分布于三条边上；V形图案上端非黏附开口区域微丝应力纤维强度较低；T形图案两端非黏附开口区域则形成了非常明显的应力纤维（图2（a）（b））。将多个细胞荧光图像进行叠加更加凸显了细胞在不同几何形状ECM微丝骨架纤维分布的不同（图2（c）（d））。在V形图案上，上端开口延伸到内部的黏附区域有效分担了细胞边缘所承担的应力，因此在此处没有形成密集的应力纤维束，而在T形图案两端非黏附开口区域，细胞需要维持铺展形态，从而形成了密集的应力纤维结构（图2（e））。这一结果表明，尽管细胞外观形态类似，但处于不同的ECM构造的力学环境中微丝骨架分布存在明显差异。

图2：不同形状ECM图案诱导的细胞微丝骨架差异性分布。（a）FN图案。（b）微丝骨架免疫荧光染色。（c）多细胞免疫荧光图像叠加。（d）微丝骨架免疫荧光强度三维分布。（e）细胞不同ECM图案应力分析

2.ECM尺寸调控微丝骨架的分布与结构

为探究ECM尺寸对于细胞微丝骨架分布的影响，设计了不同尺寸的圆形细胞黏附图案（30,40,50μm，图3（a））。免疫荧光结果表明，在30和40微米尺寸的圆形图案中，细胞微丝骨架集中于细胞外周，而在50微米圆形图案中，细胞的微丝骨架出现了一个“二级环”结构，即除了最外周微丝骨架密集区域，在稍微靠近细胞中心的位置还出现了第二个微丝骨架密集区域（图2（b-d））。推测这一“二级环”的出现与肌动蛋白逆流有关，后续利用Lifeact-RFP转染活细胞，发现圆形图案化的细胞确实存在从边缘向内部的肌动蛋白逆流，并且被细胞中心的细胞核和细胞器阻拦并累积，从而形成了“二级环”。上述结果表明，ECM的尺寸可以调控细胞微丝骨架的结构与分布。

图3：不同尺寸圆形ECM诱导的细胞微丝骨架差异性分布。（a）FN图案。（b）微丝骨架免疫荧光染色。（c）多细胞免疫荧光图像叠加。（d）微丝骨架免疫荧光强度三维分布。

3.不同细胞类型具有不同的微丝骨架分布

为探究不同种类细胞对于相同的ECM图案是否会形成相同的微丝骨架分布，分别使用了成骨细胞、MDCK上皮细胞以及A549肺癌细胞。结果表明成骨细胞和MDCK细胞在T形图案两端非黏附区域会形成明显的微丝应力纤维，而A549细胞则不会形成应力纤维。这一结果表明不同细胞内秉性质的不同会导致其在相同力学环境存在不同的微丝骨架结构排布，这可能与细胞不同功能密切相关。

图4：不同类型细胞（成骨细胞（a），MDCK细胞（b），A549细胞（c））在T形ECM图案诱导的细胞微丝骨架差异性分布

综上所述，本文基于光刻图案化技术，探究了ECM图案、尺寸以及细胞类型对于微丝骨架的结构的影响。相关结果有助于理解细胞外微环境对于细胞骨架乃至细胞生理过程的调控机制。

通讯作者简介

潘雷霆，南开大学物理科学学院教授、博导，药物化学生物学国家重点实验室兼聘教授。主要从事纳微尺度细胞成像与操控研究，包括超分辨光学成像及其生物医学应用、细胞光刻图案化操控、光生物学效应等生物与光学交叉领域科学研究。以第一或者通讯作者在Advanced Science, Cell Reports, Small Methods, iScience, Biophysical Journal等杂志发表SCI/EI收录论文30余篇，授权发明专利一项。主持国家重点研发计划项目1项（课题负责人）、国家自然科学基金4项、天津市自然科学基金1项等。目前任中国光学学会生物医学光子学专业委员会副秘书长、中国电子显微镜学会共聚焦专业委员会副主任、中国微循环学会血液治疗专业委员会常委、《中国激光》杂志青年编委，《Advanced Science》、《The Innovation》、《ACS Nano》、《Biomedical Optics Express》、《Journal of Cellular Physiology》、《Optics Letters》和《中国激光》等多个学科领域杂志审稿人。