本文介绍的是深圳大学物理与光电工程学院王科教授课题组在2200nm波段通过三次谐波实现活体小鼠深层皮肤成像研究，发表在《Journal of Innovative Optical Health Sciences》期刊2023年第4期。

Deep-skin third-harmonic generation (THG) imaging in vivo excited at the 2200 nm window

2200nm波段活体动物深层皮肤三次谐波成像研究

Xinlin Chen, Yi Pan, Ping Qiu and Ke Wang

研究背景

皮肤是人体最大的器官，也是第一道防线，它具有保护、调节和感觉等多种功能。为了在细胞水平上观察和研究皮肤的结构和功能，光学成像是一种必不可少的技术手段。在各种光学成像模式中，多光子显微镜（MPM）是一种独特的光学成像模式，它利用长激发波长来减少组织散射，实现三维（3D）切片成像，并且能够产生二次/三次谐波和内源性多光子荧光等多种多光子信号。皮肤的多层异质结构导致激发光在组织内发生散射和像差，从而降低了多光子显微镜的信号强度和分辨率，尤其是在深层成像中。一种有效的方法是在避开水的吸收峰的同时使用更长的激发波长以减少组织的散射和像差。目前已经发现有三个适合皮肤多光子显微成像的激发波段——800nm、1300nm和1700nm 波段。其中，1700nm波段对于深层皮肤多光子显微成像有着显著的优势。然而，还不清楚是否有更长的激发波段可以用于深层皮肤多光子显微成像。

内容简介

皮肤作为一种异质组织，它对多光子显微镜（MPM）的激发光有很强的散射和像差。为了实现更深的皮肤成像，我们使用更长的激发波长来减少皮肤带来的散射和像差影响。在此之前的研究只使用了最高达1700 nm的激发波长，但是更长的波长是否适合深层皮肤多光子显微成像还未知。我们首先测量了新鲜离体小鼠皮肤的宽谱透射率，发现2200 nm处存在一个高透射波段。在此基础上，我们利用该波段对活体小鼠皮肤进行了三次谐波显微成像。当皮肤表面功率为9mW时，我们能够观察到250μm深度内的三次谐波信号。与1700 nm波段相比，2200 nm波段的三次谐波信号随着深度的增加衰减得更慢。结果表明，2200nm波段是一个新颖而有潜力的激发波段，适用于深层皮肤多光子显微成像。

图文导读

1.实验装置

图1：(a)实验装置图。L1:f=50mm透镜;L2:f=40mm透镜;L3:f=100mm透镜;L4:f=75mm透镜;LPF1:2055nm长通滤波器;LPF2:1635nm长通滤波器;HWP:半波片;M1,M2:反射镜,M1用于切换2200nm和1700nm的光路;LMA:65cm大模场光纤,PCrod:44cm光子晶体光纤。(b)1700nm激光光谱。(c)2200nm激光光谱

实验装置如图1(a)所示，2200nm和1700nm飞秒脉冲都是通过孤子自频移 (SSFS)的非线性光学效应产生，泵浦源是1550nm、1MHz、500fs光纤激光器(FLCPA-02CSZU,Calmar)。2200nm孤子脉冲是在65cm的大模场光纤 (LMA-PM-35, NKT Photonics) 中产生的。图1(c)显示经过一个2055nm的长通滤波器(LP-2055nm,Spectrogon)后的光谱。随后用一个布儒斯特角的2mm锗片来压缩脉冲，从而在样品处得到98fs的脉宽。1700nm孤子脉冲是在44cm光子晶体棒(SC-1500/100-Si-ROD,NKTPhotonics)中产生，经过1635nm长通滤波器(1635LPF,OmegaOptical)后测量的光谱如图1(b)所示。样品上的脉宽为88fs。激光扫描显微镜(MOM,Sutter)系统的扫描透镜(LA5763-D,Thorlabs)和管透镜(ACA254-200-D,Thorlabs)在2200nm波段都有高透射率。我们采用数值孔径（NA）为1.05的水浸物镜（XLPLN25XWMP2-SP1700,Olympus）对样品进行激发。为了降低样品表面的功率损耗，物镜采用不完全填充，并且两种激发波长下的有效数值孔径（NA）均为0.53，并用D₂O作为浸润介质。三次谐波信号都使用GaAsPMT(H7422p-50,Hamamatsu)检测的，其中2200nm的三次谐波信号用732/68-nm带通滤波器(FF01-732/68-25,Semrock)，而1700nm的三次谐波信号用了560/94-nm带通滤波器(FF01-560/94-25,Semrock)。

2.新鲜离体皮肤宽谱透射率测量

图2：测量从500nm到2500nm的新鲜离体小鼠皮肤的透射率(单位%，左纵坐标，红实线)。测量从1200nm到2500nm的水吸收系数α_A(单位cm^-1，右纵坐标，蓝虚线)

图2显示了三个相对高透射率的波段：1300nm、1700nm和2200nm波段，它们的透射率分别为3.18%、3.18%和2.48%，而水的吸收系数在这三个波段分别为1.31cm^-1、5.80cm^-1和19.69cm^-1。这三个激发波段与水吸收的局部最小值基本重合。另外，在1450nm和1925nm处，水的强吸收与皮肤透射率的局部最小值也基本重合。波段重合的轻微偏离的原因有以下两点原因：(1)透射率是皮肤吸收和散射的综合效果。(2)皮肤吸收除了水以外还有其他成分。尽管如此，我们仍然可以推断出，为了提高皮肤的透射率，激发波长应该选择在水吸收相对较低的波段内。因此，从这个透射率测量来看，2200nm波段对于深层皮肤多光子显微成像具有潜在的优势。

3.1700nm和2200nm活体小鼠深层皮肤三次谐波成像对比实验

图3：用1700nm(a),(b),(d),(f)和2200nm(c),(e),(g),(h)激发的三次谐波图像。(a),(h)三维重构图像。(b)-(g)三维重构中的二维图像。每个二维图像都标明了距离皮肤表面的成像深度，并分别进行了对比度增强，使得最大像素亮度为65,535。比例尺：50μm；像素大小：512x512

图3展示了使用1700nm或2200nm激发波长的三次谐波活体小鼠皮肤成像所得的三维皮肤重构图像。每张图像都进行单独的增强处理使最大像素亮度相同。从1700nm和2200nm三次谐波成像结果可知，随着成像深度的增加，皮肤中的角质层（图3（b）和3（c））、皮脂腺（图3（d）和3（e））和脂肪细胞（图3（f）和3（g））等结构具有相似性。然而，在距离皮下220μm至250μm的位置，2200nm三次谐波图像中的脂肪细胞能清晰地辨认。相比之下，在同样的成像深度下，1700nm三次谐波图像中无法分辨出脂肪细胞。这些结果表明，在相同的光功率条件下，2200nm能够实现比1700nm更大的成像深度。

4.1700nm和2200nm活体小鼠深层皮肤三次谐波成像详细对比图

图4：使用1700nm（a）、（c）、（e）、（g）和2200nm（b）、（d）、（f）、（h）相同深度的三次谐波成像，并标注相应的成像深度，每一对图像亮度颜色尺度相同。比例尺：50μm；像素大小：512×512

5.1700nm与2200nm三次谐波信号强度比与成像深度之间的关系曲线

图5：，三次谐波信号比S₂₂₀₀/S₁₇₀₀与成像深度之间的关系曲线。在z=160μm处，进行归一化处理S₂₂₀₀=S₁₇₀₀=1

为了更清楚地展示两种激发波长下三次谐波信号在皮肤深层的差异，我们提取相同深度的图像，并对每一对图像使用相同的颜色尺度来表示两种激发波长下的信号水平（图4）。在z=160μm处，两幅图像都呈现出类似的信号强度。然而，随着成像深度的增加，1700nm三次谐波信号强度逐步低于2200nm。为了定量地比较两种激发波长下的信号强度衰减，我们采用了以下方法：（1）由于在z=160μm以下采集的图像，激光功率都为9mW，因此计算每个图像中两种激发波长下的三次谐波的平均信号S₂₂₀₀和S₁₇₀₀。（2）接着，计算S₂₂₀₀/S₁₇₀₀的比值，并在z=160μm处做归一化处理，然后将其绘制成与成像深度的相关的曲线。如图5所示。正如预期的那样，该比率随着成像深度的增加而增加，这与成像结果一致。

6.1700nm与2200nm深层皮肤三次谐波成像的分辨率对比

图6：在1700nm（a）和2200nm（c）激发的皮表下170μm脂肪细胞的三次谐波图像。沿（a）和（c）中的黄线测量其线轮廓分别显示在（b）和（d）中。用高斯拟合测量半高宽（红色曲线）也显示在（b，d）中。比例尺：10μm

为评估和对比两种激发波长下的空间分辨率，我们对横向尺寸最小的皮肤结构脂肪细胞膜进行成像，如图6（a）和6（c）所示。在相同脂肪细胞膜位置选取线轮廓，并绘制了其强度分布图（图6（b）和6（d））。随后用高斯函数对测量得到的信号强度分布进行拟合，得到1700nm和2200nm激发波长的平均半高宽分别为1.49μm和2.40μm。其中2200nm较长的激发波长导致较低的空间分辨率。

7.1700nm和2200nm像差与多光子信号衰减的理论分析

图7：1700nm和2200nm激发下球面像差引起的多光子信号随着深度的增加而衰退的曲线图

像差是从表面到焦点的相位积累，与波长成反比。理论上，经过相同的组织后，较长的波长比较短的波长累积更少的像差。众所周知，像差越大，多光子信号越差。我们使用像差理论模型，计算了2200nm球面像差引起的多光子信号之间的关系，并将其与1700nm进行了比较。我们的结果表明（图7），随着成像深度的增加，1700nm比2200nm更容易受到球面像差影响。因此，激发波长差异和像差都可能是2200nm比1700nm更深地穿透皮肤的主要因素。

通讯作者简介

王科,深圳大学物理与光电工程学院特聘教授，博导，国家级青年人才计划入选者，广东省特支计划青年人才。研究方向为超快光纤激光及多光子成像，开发了1700nm及2200nm波段激发多光子深层生物组织成像技术及系统。在Nature Photonics、ACS Nano等发表论文80余篇，单篇最高引用次数超1400次。主持多项国家级、省部级科研项目。