Three-dimensional remodeling of collagen fibers within cervical tissues in pregnancy

Lingxi Zhou, Rushan Jiang, Jia Meng, Shuhao Qian, Shenyi Jiang, Chuncheng Wang, Chen Yang, Zhihua Ding, Zheyue Shu, and Zhiyi Liu

研究背景

早产 (PTB) 最常见的定义是孕妇妊娠不足37周就分娩。由早产引起的一系列并发症，如脑室内出血 (IVH)、呼吸窘迫综合征 (RDS) 等是全球新生儿死亡的主要原因，约占全球新生儿的10.6%。子宫颈是一种富含胶原纤维的结缔组织，在怀孕期间会保持闭合，同时会进行一定程度的重塑，为分娩做准备。在临产前，子宫颈开始由封闭的刚性结构向开放式结构转变。这是一个动态过程，可分为软化、成熟、扩张和产后重塑四个阶段。既往研究表明，异常或不合时宜的宫颈重塑可导致早产，而胶原纤维是影响子宫颈拉伸性能的主要结构蛋白。因此，胶原纤维的形态和结构变化可以作为监测妊娠期宫颈重塑的重要生物标记物。由于胶原纤维具有较强二阶非线性极化率和非中心对称结构，二次谐波 (SHG) 成像成为了研究胶原纤维形态特征的首选工具。SHG成像可以在亚微米级别的分辨率下实现不同组织胶原纤维的无标记成像。然而，即使胶原纤维的高分辨率三维 (3D) 图像很容易获取，对于胶原纤维空间形态特征的定量表征方法仍然很大程度上局限于对二维 (2D) 图像的分析。

内容简介

胶原纤维是子宫颈的主要组成部分。因此，研究宫颈重塑过程中胶原纤维的形态变化对预防早产具有重要意义。为此,我们分别对进入妊娠期3、9、12、15和18天小鼠宫颈组织中的胶原纤维做了三维(3D)成像与定量分析。我们发现胶原纤维的三维方向方差（一种用来评估胶原纤维空间有序程度的新参量）在第9天的时候比第3天时的要高；而在第9天到第18天期间，又会逐渐降低。同时，与传统的二维(2D) 分析方法相比，三维分析获得了更高的灵敏度，突出了三维定量表征的重要性。此外，还研究了不同时期胶原纤维的三维方向方差在成像深度方向上的变化。结合多个三维方向方差的衍生指标，在区分妊娠期不同阶段时获得了较高的分类准确性。这些结果证明了三维方向方差对宫颈组织内胶原纤维的重塑很敏感，为早产的早期诊断提供了新的可能性。

图文导读

1.实验装置、纤维状结构三维方向角以及三维方向方差算法的验证

图1 样品的制备示意图，成像系统和纤维状结构三维排列的分析算法。(a) 采集组织的位置和成像区域以及成像系统的布局。BP，带通滤波器；DCM，色散补偿模块；DM，二向色镜；PMT，光电倍增管。(b) 三维空间中描述某一方向（紫红色线条）的角度定义。(c) 通过对比仿真的三维纤维状结构方向方差图（中行）和相应方向方差分布直方图（下行）与实际排列的整齐程度来验证分析算法。

成像系统如图1(a)所示，SHG和双光子激发荧光(TPEF) 图像(512x512pixels;386x386 μm)由特制的多光子显微镜采集。锁模钛宝石激光器(Spectra Physics, MaiTai) 发射出的激光(800 nm,平均功率40 mW) 由25倍水浸物镜(NA = 0.95，工作距离2.4 mm) 聚焦，用于激发二次谐波和内源性荧光团（如NAD(P)H，FAD等）。SHG和荧光信号通过同一个物镜收集，并通过一系列的二向色镜和滤光片分离。光信号由一对光电倍增管(PMT) 收集，每个PMT后面都有一个带通滤波器用于隔离SHG信号(400nm±10 nm)或荧光信号(460nm±20 nm)。如图1(a)所示，成像区域选在宫颈内管的右侧、距离表面鳞状细胞100 μm深处。为了描述三维空间中胶原纤维的空间取向，我们定义了几个特殊的角度，如图1(b)所示。其中θ表示胶原纤维在xy平面上的投影与x轴正方向的夹角，φ表示胶原纤维与z轴负方向的夹角。同时为了更方便地计算φ角，又定义了β角和γ角，其分别代表了胶原纤维在xz平面上的投影与x轴正方向的夹角以及胶原纤维在yz平面上的投影与y轴负方向的夹角。然后再根据区域内每根胶原纤维的θ角和φ角，可以计算得到胶原纤维的三维方向方差。

为了证明三维方向方差算法在描述纤维状结构空间有序程度方面的能力，我们仿真了四个大小为200x200x200像素、包含多个纤维状结构的堆栈，如图1(c)所示，其空间排列整齐程度由左至右依次降低（方向方差依次升高）。然后分别对四个堆栈应用三维方向方差算法，得到三维方向方差图谱以及对应的分布直方图。正如预期那样，越整齐的堆栈对应了越低的分布直方图峰值位置，反之亦然。这些结果证明了三维方向方差算法具有高灵敏度，能够准确地描述三维空间中纤维状结构的有序程度。

2.妊娠期不同阶段胶原纤维的三维空间取向与方向方差

图2 从妊娠期不同阶段获得的组织样本的代表性图像以及对应的参量图。(a) 妊娠第3、9、12、15和18天的SHG图像；(b) 伪彩色编码的θ图；(c) 伪彩色编码的φ图；(d) 三维方向方差图；(e) 三维方向方差分布直方图。

我们分别对进入妊娠期3、9、12、15和18天小鼠的宫颈组织中胶原纤维的三维取向与空间有序度进行了分析。不同时期胶原纤维在同一深度下的代表性SHG图像如图2(a)所示。将我们的三维取向算法运用到这些特定时期胶原纤维的三维图像堆栈，可以获得相应的θ角(图2b) 和φ角(图2c) 分布图。第3天的胶原纤维θ角分布图呈现出相对均匀的色调，这表明这时大部分胶原纤维沿着某一特定的方向排列，有别于第9天时杂乱无章的排列(图2b)。此外，所有时期的φ角分布图都呈现出绿色色调（对应90度的φ角），这表明大部分的胶原纤维都垂直于我们观察的二维平面(图2c)。进而，我们获得这些时间点的三维方向方差(图2d)，以及对应的分布直方图(图2e)。从方差图可以看出，怀孕初期的方向方差较小，说明这个阶段的胶原纤维排列得较为有序。相比之下，胶原纤维的方向方差在第9天表现出了高度的差异，对应于更加混乱的排列。而在第12、15和18天时，方差图的色调处于第3天和第9天的中间状态，表明胶原纤维可能在此期间发生了重塑。

3.二维与三维分析方法的比较

图3 三维与二维分析的对比。(a) 三维分析方法（上）和不同时间点的三维分析结果箱线图（下）；(b) 二维分析方案（上）和不同时间点的二维分析结果箱线图（下）。每个时间点包含了6个不同的样本。

为了评估三维图像分析方法的灵敏度，我们将结果与典型的二维图像分析方法进行了比较。如图3(b)所示，二维分析方法是基于逐层分析堆栈的二维方向方差得到的结果，而三维分析方法则是通过体积元进行的体素级的分析(图3a)。我们分别通过三维和二维方法计算了所有阶段的方向方差，并给出了各自对于妊娠期不同阶段的原始分类精度(OCA) 和交叉验证分类精度(CVCA)。尽管三维分析和二维分析方向方差有着类似的变化趋势，但三维分析的分类精度高于二维分析，表明了三维分析方法具有更高的灵敏度。

4.不同阶段胶原纤维三维方向方差在深度方向上的变化

图4 妊娠期不同阶段的方向方差在深度方向上变化。(a) 妊娠的第3天、第9天和第18天宫颈组织样本胶原纤维的三维重构图像；(b) 六个代表性深度上的方向方差图；(c) 随深度变化的平均三维方向方差图。

为了利用图像堆栈的三维特性，我们还评估了方向方差随深度的变化。我们分别对三个代表性时间点：第3、9、18天的三维图像堆栈(图4a) 做了分析，获得了不同成像深度下的方向方差，并展示了6个特定深度下的方向方差图(图4b)。然后，我们绘制了堆栈每一层的平均方向方差随深度变化的趋势 (图4c)。从这些图可以看出，妊娠期不同阶段的胶原纤维平均方向方差及其在深度方向上的波动表现出了不同的特征。一般来说，与第3天和第18天的样本相比，第9天样本的胶原纤维具有更高的方向方差。此外，还可观察到，与第9天的样本相比，第3天和第18天样本平均方向方差在深度方向上的变化要更大，这表明深度方向上方向方差波动也能作为区分不同妊娠期的潜在光学生物标志。

5.胶原纤维三维方向方差的衍生参量对小鼠不同妊娠期的分类结果

图5 使用不同的光学参量或其组合对妊娠期不同阶段的分类结果。(a) 不同时期MVWD的标准差的箱线图；(b) 不同时期MVWD的极差的箱线图；(c) 使用三个方向方差衍生参量对不同时期宫颈组织分类的三维散点图。

受上述观察结果的启发，我们计算了深度方向上均值方向方差(MVWD) 的标准差(STD)，来表示其深度方向上的波动，并评估了其区分不同妊娠期的能力。在对所有样本进行分类后，我们获得了53.5%的OCA和40%的CVCA (图5a)。此外，作为STD的补充，我们还计算了MVWD的极差，并对不同的妊娠期得到了56.7% OCA和53.3% CVCA的分类精度(图5b)。最后，我们研究了这些三维方向方差衍生的参量，包括MVWD的均值、标准差和极差在识别特定妊娠阶段的信息互补性。这三个参量的融合，展现出了对不同妊娠期的强大分类能力，其OCA与CVCA分别为90.0%和80.0%，比任何一个参量单独分类的精度都要高。

通讯作者简介

刘智毅，浙江大学光电科学与工程学院“百人计划”研究员，博士生导师。工作围绕先进光学成像方法的构建与图像的定量表征展开，致力于光学图像与疾病的关联性研究。迄今，在Science Advances,Laser & Photonics Reviews等国际期刊发表论文50 余篇。申请和授权了多项中国、美国专利。多次在国际会议上做邀请报告和口头报告。担任了Science Advances等20余本国际主流期刊的审稿人。获第五届全国高等学校电子信息类专业青年教师授课竞赛一等奖。以负责人身份，主持国家重点研发计划项目，国家自然科学基金青年、面上项目，浙江省自然科学基金杰出青年项目。