本文介绍的是中国科学院深圳先进技术研究院研究员徐富强课题组开发的新型逆行跨多级突触示踪方法，发表在《Journal of Innovative Optical Health Sciences》期刊2023年第6期。

Brain-wide N2cG compensation permits glycoprotein-deleted rabies virus to trace neural circuits across multiple synapses

全脑范围的N2cG补偿辅助糖蛋白缺失狂犬病毒实现逆行跨多突触标记

Nengsong Luo^#, Zengpeng Han^#, Jiaxin Kou^#, Yuxiang Cai, Xin Yang, Jie Wang, Kunzhang Lin^*and Fuqiang Xu^*

研究背景

基于野生型狂犬病毒的逆行示踪剂可以在啮齿类动物和非人灵长类动物的神经系统中进行逆行跨多突触传播，使其成为解析大脑复杂神经环路结构和功能的有力工具，但存在对人类健康构成高风险，以及无法实现起始神经元类型特异性的逆行跨突触传播等问题。“将欲取之，必姑与之。”神经环路研究中，在神经元预先补偿入胞受体实现载体重靶向（特异性感染）或预先补偿复制相关蛋白实现嗜神经病毒载体跨突触标记已成为广泛应用的策略。例如，禽类肉瘤病毒的外膜蛋白EnvA可特异性识别受体TVA，而TVA在哺乳动物细胞中无内源性表达，预先在神经元内补偿TVA，可使EnvA假型化的RV-ΔG实现特异性感染；RV具有经轴突末梢吸收逆行跨突触传播的特性，糖蛋白缺失的RV（RV-ΔG）丧失跨突触能力，预先在神经元内补偿狂犬病毒糖蛋白RVG，可实现RV逆行跨单级示踪（下一级神经元无RVG，故不能继续跨突触）。

在这些示踪系统中，蛋白的预先补偿依赖辅助病毒（通常为腺相关病毒，AAV）的递送而实现，但是在以往的研究中，通常仅使用AAV做局部递送。2017年，加州理工学院Gradinaru实验团队开发了用于C57BL/6小鼠上高效跨血脑屏障的AAV-PHP.eB突变体，使得全脑范围的蛋白补偿成为可能，也给示踪工具系统的开发与改进提供了新思路。

内容简介

本文使用跨血脑屏障的AAV-PHP.eB全脑递送RVG，在特定脑区感染糖蛋白缺失的狂犬病毒（RV-ΔG）实现逆行跨多级突触示踪。此外，结合由细胞类型特异性启动子控制表达的TVA，可以介导EnvA假型化的RV-ΔG实现起始细胞类型特异性的逆行跨多突触示踪。本文建立的新型逆行跨多级突触示踪系统，把跨血脑屏障AAV载体的优势恰当地嫁接到RV示踪系统中，使基于RV的环路标记系统实现了由点到面的跨越，对复杂神经环路的解析具有重要意义。

图文导读

1.新型逆行跨多级突触示踪策略

图1：新型逆行跨多级突触示踪策略图。（A）广谱的逆行跨多级示踪。（B）起始细胞类型特异性逆行跨多级示踪。

可用于逆行跨多级突触示踪的病毒工具包括RV和伪狂犬病毒（PRV）Bartha株，但PRV不能感染灵长类动物。基于RV的跨多级示踪工具开发面临如下问题：（1）RV野毒安全性低，可对包括人类在内的动物致命；（2）作为RNA病毒，病毒生命周期中没有DNA阶段，不能通过Cre依赖的策略实现细胞类型特异性标记。

基于此，当使用跨血脑屏障的AAV-PHP.eB全脑补偿RVG，即可实现广谱的逆行跨多级示踪（图1A），这一设计在照顾到RV的安全性问题的同时，配合使用携载特异性启动子的AAV辅助病毒，也可以实现起始细胞类型特异性逆行跨多级示踪（图1B）。

2.全脑补偿RVG实现全脑广谱逆行跨多级突触示踪

图2：全脑补偿RVG实现全脑广谱逆行跨多级突触示踪。（A）逆行跨多突触示踪示意图。静脉注射表达N2cG的辅助病毒，三周后，将B19G-CVS-N2c-ΔG-EGFP注射到初级运动区（MOp）。（B）注射部位（MOp）和上游脑区尾状壳核（CPu）的荧光表达。（C）MOp的其他上游脑区的荧光表达。VAL，丘脑腹侧前外侧复合体；BLA，基底外侧杏仁核；SUB，下托；SNr：黑质；SIM，简单小叶；DN，齿状核。左边的大图，比例尺为1mm；右边的小图片，比例尺为100μm。

为了验证前述设计策略，N2cG由rAAV-PHP.eB携载并经静脉给药进行全脑补偿，然后将B19G-CVS-N3cN2c-ΔG-EGFP注射在MOp。丘脑腹侧前外侧复合体（VAL），基底外侧杏仁核（BLA），下托（SUB），黑质（SNr），简单小叶（SIM），齿状核（DN）和尾壳核（CPu）等上游脑区均可见荧光标记信号。

3.起始细胞类型特异性的逆行跨多级突触示踪

图3：起始细胞类型特异性的逆行跨多级突触示踪。（A）起始细胞类型特异性逆行跨多突触示踪示意图。尾静脉注射表达N2cG的rAAV-PHP.eB，并在初级运动区（MOp）注射兴奋性神经元特异性启动子驱动表达TVA的rAAV9，3周后在初级运动区（MOp）注射表达tdTomato的EnvA-CVS-N2c-ΔG-tdTomato。（B）注射位点（MOp）和上游脑区尾状壳核（CPu）的荧光信号表达，左边大图的比例尺为1mm；右边小图的比例尺为200μm。（C）上游脑区红色荧光表达。ACA，前扣带区；VAL，丘脑腹侧前外侧复合体；SCm，上丘运动相关区；SNr，黑质。左边大图的比例尺为1mm；右边小图的比例尺为100μm。

为了进一步追踪MOp中兴奋性神经元的输入网络，使用AAV9将CaMKIIα启动子控制下的TVA递送到MOp中，同时通过尾静脉注射rAAV-PHP.eB进行全脑补偿N2cG，3周后在MOp注射EnvA-CVS-ΔG-tdTomato。通过脑片成像可以看出，MOp的许多上游脑区被CVS-ΔG-tdTomato标记，如前扣带区（ACA）、丘脑腹侧前外侧复合体（VAL）、上丘运动相关区（SCm）、黑质（SNr）和尾壳核（CPu）等。这些结果表明，将EnvA假型化的RV-ΔG与携带由细胞类型特异性启动子控制的表达TVA的rAAV-PHP.eB联合使用，可以实现起始细胞类型特异性跨多级突触示踪。基于这一原理，研究人员也可以使用表达TVA的Cre依赖性AAV载体，结合Cre转基因动物实现特异性标记。这项研究为神经科学研究人员解析啮齿动物和非人灵长类动物的输入神经网络提供了新的替代方法。

通讯作者简介

徐富强，中国科学院深圳先进技术研究院研究员，国家杰青，国科大特聘教授。近年主要研发用于神经环路结构和功能解析、细胞基因治疗的技术方法和工具，发明的600种转化产品被国内外1000余家实验室应用，举办的7届病毒载体技术培训班参会者有5000余人次，成果大多以技术“入股”。在包括《Science》、《Nature》、《Nature Biotechnology》、《Nature Neuroscience》、《Neuron》、《Nature Communications》、《Science Advances》、《PNAS》等期刊发表了140篇论文，申请专利60余件。

林坤章，华中科技大学/中科院精密测量科学与技术创新研究院博士，中国科学院深圳先进技术研究院博士后/助理研究员。长期从事工具病毒载体系统的研发、制备、应用和转化，支撑脑科学基础和临床研究，包括神经环路示踪新技术（RV/VSV）、溶瘤病毒载体（VSV/AAV）和基因治疗载体（AAV）等的研发。在Nature Communications、Science Bulletin、NeuroImage 、Neural Regeneration Research等期刊发表SCI论文10余篇，申请/授权国际国内发明专利30余件，实现专利成果产业转化2件。全脑介观神经联接图谱绘制技术平台（子课题3：神经环路标记技术分平台）和中国科学院战略性先导科技专项（B类）脑联接图谱绘制新技术等项目的骨干成员。主持国家自然科学基金1项，参与5项，应邀为Neural Regeneration Research等多个SCI杂志审稿。