本文介绍的是海南大学生物医学工程学院王亚龙副教授对AIE型水溶性免漂洗Aβ探针的设计与研究，发表在《Journal of InnovativeOptical Health Sciences》期刊2023年第6期。

Development of water-soluble AIE-based wash-freeAβprobes superior to commercial ThT

优于商用探针ThT的AIE型水溶性免漂洗Aβ探针的开发

Ting-Ting Hou, Ying-Hao Tang, Zhen-Yu Zhang, Ze-Jun Liand Ya-Long Wang*

研究背景

目前，阿尔茨海默病(AD)是一种典型的神经退行性疾病。淀粉样蛋白(Aβ)是与AD进展相关最突出的病理生物标志物之一。荧光成像具有成本低、操作简单、数据分析容易等优点，更适合动物研究。因此，针对Aβ发展早期诊断技术，设计开发能在体内外特异性靶向Aβ的荧光探针，对于AD的研究具有重要的意义。荧光探针在生物医学领域的应用不仅为生物物种的各项生理活动（细胞、亚细胞）提供了直接可视化的能力。然而，由于聚集诱导猝灭（Aggregation-Caused Quenching，ACQ）现象，导致传统荧光探针信噪比低、易光漂白，限制了它在生物系统中的应用。聚集诱导发光（Aggregation-Induced Emission，AIE）的发现为这一难题带来了解决方案。

内容简介

传统的Aβ探针，包括商用探针ThT，染色过程通常需要繁琐的漂洗步骤。本文中，作者设计了两种AIE活性的水溶性Aβ探针DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH（图1），与商用探针ThT相比，DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH对Aβ聚集体表现出更好的亲和力。此外，对于ThT，漂洗步骤对获得AD脑组织切片中Aβ斑块的高信噪比图像是必不可少的。而对于DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH，即使不需要漂洗步骤，也能获得Aβ斑块的高信噪比图像。

图文导读

1.探针结构设计

基于ThT，设计了AIE活性的水溶性Aβ探针。苯胺基团作为电子供体（D）和Aβ结合基团，吡啶阳离子作为电子受体（A）和水溶性基团。通过碳-碳双键（C=C）桥接，构建了具有D-A结构的水溶性探针DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH。它们在生理环境中不发射荧光，但在与Aβ聚集体结合后发出强烈的红色荧光。与Aβ的商用探针ThT相比，两种AIE活性的Aβ探针表现出优异的灵敏度和亲和力，即使没有繁琐的洗涤程序，也能在AD脑组织切片中以高SNR标记Aβ斑块。

图1：红色荧光的AIE型水溶性Aβ探针的设计

2.探针的光学性质

在水溶液中测量了ThT、DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH的紫外-可见吸收和光致发光（PL）光谱。ThT的最大吸收峰和发射峰分别位于~410 nm和~480 nm。与ThT相比，DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH的最大吸收峰位于~480 nm处，由于共轭结构的延伸，红移~70 nm。它们的发射峰位于~630 nm处，与ThT相比，红移了~150 nm（图2）。

图2：（a）ThT、DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH在水中的紫外-可见吸收光谱。（b）ThT、DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH在水中的发射光谱。

3.探针的AIE性质

由于探针DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH是水溶性化合物，因此它们可溶于极性溶剂水，难溶于低极性溶剂四氢呋喃（THF）。因此，研究了它们在THF/水混合物中的AIE特性（图3）。由于非辐射跃迁，探针在水中显示出微弱的发射。当添加不良溶剂THF时，由于分子内运动受限（RIM）激活了辐射跃迁，荧光开启。荧光随着THF含量的增加而逐渐增强。当THF含量提高到99%时，DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH的荧光显著增强，发射比在水中分别增强约25倍和79倍。结果表明，DE-V1-PYOH和DE-V1-PYC3都是典型的AIE水溶性分子。探针在水中的荧光可以忽略不计，有利于在生物检测中降低背景干扰，实现“off-on”检测。

图3：DE-V1-PYC3（a）和DE-V1-PYOH（b）在不同THF含量的THF/水混合物中的发射光谱。染料浓度：10μM。

4.探针与Aβ纤维的亲和力

作为水溶性化合物，DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH 在PBS（10 mM，pH = 7.4）中荧光可忽略不计。加入10μM Aβ_1-42纤维后，ThT的荧光强度增加了近16倍，DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH的荧光强度分别增加了近22倍和18倍（图4a-b）。为检验水溶性对Aβ纤维的亲和力，比较了探针DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH与商用Aβ探针ThT的亲和力。通过将ThT（5μM）与Aβ聚集体（10μM）预混合，制备了ThT/Aβ_1-42聚集体，在~486 nm处显示出强烈的绿色发射。当逐渐加入DE-V1-PYC3（0-3μM）时，ThT在486 nm处的荧光急剧减弱，而DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH在605 nm处的荧光急剧增加（图4c-f）。这可能是由于DE-V1-PYC3/DE-V1-PYOH取代了ThT/Aβ_1-42聚集体中的ThT，表明DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH与Aβ聚集体的亲和力优于商用探针ThT。

图4：DE-V1-PYC3（a）和 DE-V1-PYOH（b）在不同 Aβ_1-42纤维含量的PBS溶液中的发射光谱（染料浓度：2μM）。DE-V1-PYC3（c）和DE-V1-PYOH（e）可有效置换ThT/Aβ_1-42纤维复合物中的ThT。486 nm和605 nm处峰的发射峰强度随DE-V1-PYC3（d）和DE-V1-PYOH（f）浓度的变化趋势。

5.分子对接模型及理论计算

利用薛定谔软件进行模拟计算，研究了ThT、DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH与Aβ的结合模型。结果表明，这三种分子都可以插入Aβ的空腔中，并与氨基酸残基产生相互作用，从而限制了分子的运动（图5）。因此，由于分子内运动（RIM）的限制，ThT、DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH对Aβ表现出优异的荧光响应。与ThT相比，DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH与Aβ空腔内氨基酸残基产生更多的相互作用，因此对Aβ的亲和力优于商用探针ThT。

图5：ThT（a）、DE-V1-PYC3（b）和 DE-V1-PYOH（c）的三维模型与Aβ纤维结合。虚线表示分子与Aβ纤维氨基酸残基的相互作用，黄色虚线表示氢键相互作用，粉红色虚线表示盐桥。

6.荧光共定位成像

图6：AD小鼠脑组织切片中Aβ斑块的荧光成像。（a）（e）ThT染色、（b）DE-V1-PYOH染色和（f）DE-V1-PYC3染色。（c）（g）合并的图像。（d）（h）皮尔逊相关系数分析。比例尺：50μm。

为了验证DE-V1-PYC3和DE-V1-PYOH对Aβ斑块的靶向性，进一步对AD小鼠（5xFAD，9个月）脑组织中的Aβ斑块进行了共定位染色。共定位成像显示，DE-V1-PYC3发出的红色荧光斑点与ThT的绿色荧光斑点几乎重叠，Pearson相关系数（Rp）为0.91（图6a-d）。同样，DE-V1-PYOH发出的红色荧光斑点与ThT的绿色荧光斑点几乎重叠，Pearson相关系数（Rp）为0.96（图6e-h），表现出优异的靶向性。

7.免漂洗成像

进一步对ThT、DE-V1-PYOH和DE-V1-PYC3染色的AD脑组织切片进行免漂洗试验。对于ThT，免漂洗样本显示出较强的背景干扰，信噪比为~4。用50% EtOH/H₂O漂洗后，背景荧光显著降低，信噪比提升至~15。而对于DE-V1-PYOH和DE-V1-PYC3，免漂洗和漂洗样本的背景干扰都很弱，表现出较高的信噪比，分别为~14 和~18。结果表明，与ThT相比，DE-V1-PYOH和DE-V1-PYC3无需繁琐的漂洗步骤即可清晰的标记Aβ斑块，这将有效提高标记效率。

图8：ThT（a-c）、DM-V1-PYOH（d-f）和DM-V1CN-PYOH（g-i）的免漂洗成像研究。（a）（d）（g）免漂洗，（b）（e）（h）漂洗。（c）（f）（i）黄线区域的信噪比。比例尺：50μm。

通讯作者简介

王亚龙,海南大学生物医学工程学院副教授，博士生导师。长期从事有机光功能材料的开发及应用研究。在JACS、CEJ、ACS AMI等期刊发表SCI论文20余篇。主持各类国家、省部级项目2项，授权国内发明专利6项。