本文介绍的是上海交通大学密西根学院陈松良副教授课题组关于时间门控荧光成像技术及其生物学应用的研究进展，发表在《Journal of Innovative Optical Health Sciences》期刊2020年第3期。

Time-gated fluorescence imaging: Advances in technology and biological applications

https://doi.org/10.1142/S1793545820300062https://doi.org/10.1142/S1793545817300026

研究背景

时间门控荧光成像从被发现到现在已经历了三十多年时间。作为一种从时间维度分辨成像目标的独特技术，该技术引起了科研人员的关注。随着人们对荧光、其他光致发光现象以及物质性质的认识不断加深，随着激发光源和光电探测器件的进步，不同原理的时间门控荧光成像方法持续发展和进步，最终被应用于多种生物医学研究。不同的设备和方法在成像系统的成本和性能各有优势。本文对时间门控荧光成像技术进行综述，以便让对此技术感兴趣的科研人员在开发或发展基于该技术的成像系统时有更好的参考。此外，近十年内有许多相关的优秀研究成果，本综述也对这些最新的研究工作也进行了回顾。

内容简介

本文对时间门控荧光成像采用的技术和在生物医学领域的最新研究进展进行了综述，具体从时间门控荧光成像原理，实现该成像技术的器件和方法，以及该成像技术在生物医学领域的应用这三个方面介绍了相关研究成果。部分利用光致发光（非荧光）材料制成的探针来实现的时间门控成像的研究工作也包含在本文中。

图文导读

图1 (a) 时间门控成像信号寿命周期的示意图。(b) 多个周期信号重复采集的示意图。

当荧光物质被光激发时，激发的电子短暂停留并离开激发态返回基态发出光子的平均时间，称为荧光寿命。如图1所示，对于最简单情况，短暂激发后荧光（或发光）强度随指数级衰减至发光强度的1/e，所经过的时间可定义成荧光（或发光）信号的寿命。利用不同物质荧光（或发光）寿命的差异，可以从时间维度来分辨它们，即刻意不探测短寿命的信号，只探测长寿命的信号，便可以获得高对比度的长寿命荧光（或发光）物质成像。最终利用多周期信号采集，增加信噪比，可提高成像质量，减少短寿命的背景荧光（或其他发光）对图像的干扰。

本文首先对时间门控荧光成像系统的硬件设备，如激发光源和探测器件进行了归纳总结。

表1 时间门控成像系统中不同激发光源的波长、脉冲、功率、光斑质量以及成本的比较。对于激发光源而言，可调激发波长的光源能允许使用更多类型的荧光探针。脉冲光源持续时间越短，时间分辨率越高。通常，具有脉冲持续时间短，功率稳定性好，光束聚焦的质量好且成本低的脉冲激光光源更受青睐。

表2 时间门控成像系统中不同探测器的性能与成本比较。

对于探测器而言，单光子雪崩二极管（SPAD）和光电倍增管（PMT）灵敏度最高但价格昂贵。基于电荷耦合器件（CCD）、互补金属氧化物半导体（CMOS）的相机因价格便宜而被广泛应用。增强型（ICCD）以及电荷放大型电荷耦合器件（EMCCD）相机性能和价格通常介于上述两类之间。因此，需要在时间门控分辨率，成像质量和探测器的成本之间做出权衡。

本文对基于光学斩波器的时间门控成像原理进行了归纳总结。实现的原理方法主要被分成以下四种（见图2，图3，图4，图6）。

图2 基于光学斩波器的方法(i)

图2展示了早期利用光学斩波器实现的时间门控成像系统。如图所示，利用靠近斩波器叶片的传感器得到发射光路（Emission beam）的脉冲间隔或相位信息，通过延时电路后，反馈控制激发光源。最终使通过斩波器调制后的激发光路（Excitation beam）和发射光路的脉冲之间形成固定的时间门控延时。此时的探测器便可以实现时间门控成像。

图3 基于光学斩波器的方法(ii)

图3展示了利用两个光学斩波器实现的时间门控成像系统。如图所示，利用函数发生器和延时电路控制两个斩波器控制器，从而改变两个斩波器的相对相位，形成稳定的相位差。最终使通过斩波器调制后的激发光路和发射光路的脉冲形成固定的时间门控延时。此时的探测器便可以实现时间门控成像。

图4 基于光学斩波器的方法(iii)

图4展示的方法为使用单个斩波器并借助了延时电路，使脉冲激发光源产生的脉冲与通过斩波器调制后的发射脉冲形成固定的延时来实现时间门控探测。

图5 基于方法(iii)的时间门控成像系统举例。(a) Jin等人展示了基于该方法的一种低成本的时间门控成像系统，该系统可以方便肉眼直接观察被染色的样本。(b) Cheng等人基于方法(iii) 开发的系统，同步斩波器和脉冲激光的TTL信号由数字波形产生器来产生。

图6 (a) 基于光学斩波器的方法(iv)。(b) 该方法主要利用改变激发光路和发射光路在同一个斩波器上的相对位置来实现对激发光路脉冲和发射光路脉冲的相对相位调制。(c) 被同一个斩波器调制后，激发脉冲和发射脉冲（对应探测时间窗口）形成固定的时间门控延时。

如图6所示，相比其他基于光学斩波器的方法，该方法只利用斩波器叶片的几何结构（可以看作纯光机械的方法），并通过改变两路光的经过斩波器叶片时的相对位置，便可调制时间门控的延时。

本文对完全基于电路调制的时间门控成像系统也进行了归纳和总结。实现的原理主要有以下三种：(i) 利用光纤延时线增加被光电探测器探测到的脉冲的延时，再和控制脉冲激光的控制电路进行同步，可实现时间门控探测；(ii) 单纯地延时电路控制探测器的探测时间；(iii) 使用时间相关的单光子计数（TCSPC）模块，该方法的原理简言之是利用电路产生延时脉冲信号来调制激发和探测。在进行时间门控荧光成像的信号采集时，为了捕获最大的发光信号强度以优化图像质量，需要快速开关激发光源，同时确保时间门控延时足够短。就此而言，基于延时电路调制的时间门控成像系统往往比基于光学斩波器光机械调制的系统要有优势，即更高的时间分辨率和成像质量，可允许的荧光探针选择更多。但基于延时电路调制的方法通常使用脉冲激光器，因此系统的成本比可使用普通LED光源和连续激光器的光机械方法要昂贵。

在时间门控成像技术的应用中，硬件系统一般随着使用的探针而有不同选择。通常，对于寿命足够长的探针，基于光学斩波器的成像系统可以很好地完成任务并减少成本。对于寿命不够长的探针，还是有必要采用昂贵但高灵敏的探测器，高时间分辨率的脉冲激光器以及电路调制方法来实现。本文最后对利用上述时间门控荧光（发光）成像系统和设计的长寿命荧光（发光）探针展开的生物医学研究进行了归纳和总结（见原文表5）。研究的应用主要分为：染色体，细胞，微生物，动物组织。

图7 被cyanine3标记的DNA阵列的(a)普通荧光成像（Without TG delay）和(b)时间门控(With TG delay)荧光成像对比。

图8 (a)(b)HeLa细胞以及(c)AtT-20细胞被探针标记后，显微镜明场（bright-field）、普通荧光成像（CW image）、和时间门控荧光成像（TG image）的对比。

图9 (a) 血管中A20癌症细胞被QD探针标记后传统落射式荧光显微镜成像结果。(b) 自发背景荧光和探针发光强度随门控延时变化的曲线（虚线表示时间门控的延时）。(c) 连续的三幅图像体现该细胞在血管中的流动。

图10 (a)贾第虫及囊肿，(b)隐孢子虫及卵囊和(c)大型溞被探针染色后，普通荧光成像和时间门控荧光成像的对比。

图11 (a)斑马鱼胚胎和(b)斑马鱼幼鱼被探针染色后，显微镜明场、普通荧光成像和时间门控荧光成像的对比。

图12 小鼠器官组织（脑，肝，心，肾，肺，脾，肿瘤）被探针染色后，普通荧光成像和时间门控荧光成像的对比。

图13 人体离体扁桃体组织被探针染色后，显微镜明场、普通荧光成像和时间门控荧光成像的对比。

通讯作者简介：

陈松良教授，上海交通大学密西根学院副教授。2011年于美国密西根大学取得博士学位，2012年至2013年在美国密西根大学医学院放射科从事博士后研究工作，2013年5月起就职于上海交通大学。研究领域是光声成像的技术与应用、多模态光学成像系统、和生物医学光学成像。在相关领域发表SCI论文30余篇，包括在Nature Photonics、Analytical Chemistry、ACS Applied Energy Materials、ACS Applied Nano Materials、Photoacoustics、和Journal of Biophotonics等。申请发明专利5项。研究成果曾被Advances in Engineering、Biophotonics.Wrold、Gizmag Emerging Technology Magazine、IEEE Spectrum、Michigan News、R&D Magazine、Radiology Daily、和Science Daily等主流科学媒体报道。曾入选2014年上海市浦江人才计划。

博士生杨文钊为本文的第一作者。

期刊简介

Journalof Innovative Optical Health Science (JIOHS)期刊由新加坡World Scientific Publishing Co.和华中科技大学《创新光学健康科学杂志（英文）》编辑部共同出版，海南大学校长、华中科技大学武汉光电国家研究中心主任骆清铭院士担任主编。JIOHS期刊已被SCI、Ei、Scopus等数据库收录，2018年期刊IF为1.058，且为开放获取（OA）期刊。

该刊宗旨为集中反映光电生物医学与健康工程领域的最新进展，为光子学在生物和医学领域的研究提供一个国际平台。内容包括：光子治疗学和诊断学、光学临床运用技术与系统、组织光学、激光生物组织相互作用和组织工程学、生物医学光谱学、高级显微和成像技术、纳米生物光子学和光学分子成像、多模式混合生物医学成像、微纳加工和医学微系统。

更多期刊详情可见：

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