本文介绍的是麦考瑞大学分子科学系王玉玲副教授课题组对拉曼分子嵌入式核-壳结构（核-拉曼分子-壳）的SERS纳米粒子的合成、表征及稳定性的研究，发表在《Journal of Innovative Optical Health Sciences》期刊2021年第4期。

拉曼分子嵌入式核-壳结构SERS纳米粒子的合成与表征

Synthesis and characterization of reporter molecules embedded core-shell nanoparticles as SERS nanotags

Chloe Duffield,NanaLyuand Yuling Wang

研究背景

表面增强拉曼散射（Surface-enhanced Raman scattering, SERS）技术，是一种灵敏的，特异的基于纳米金属材料表面的拉曼增强效应的分子检测技术，可用多种疾病的临床诊断和预后。为实现SERS技术的临床应用，我们提出一种更为优化的合成方法，用于获得灵敏的、稳定的、可重现的拉曼信号。

内容简介

本文使用对苯二酚作为还原剂，对大量合成拉曼分子嵌入式金-银核壳结构（Au@Ra@AgNPs）纳米粒子的合成条件进行优化。紫外-可见（UV-Vis）光谱和扫面电镜（TEM）的表征结果表明，当硝酸银和对苯二酚的比例为2:1时，可以在金纳米核上获得更均匀的银包衣以及更强、更稳定的拉曼信号。对优化的Au@Ra@AgNPs纳米粒子进行为期两周的稳定性考察，结果表明这些纳米粒子较为稳定，拉曼信号变化较少。抗体偶联SERS纳米粒子的稳定性对疾病的诊断至关重要，因此，我们进一步考察了anti-EpCAM抗体偶联的SERS纳米粒子的稳定性，UV-Vis光谱和SERS光谱结果显示抗体偶联的SERS纳米粒子的UV-Vis吸收和拉曼信号在8天内较为稳定。这些结果表明本文中合成的纳米粒子尺寸均匀，信号可重现且能大量合成，在未来有望用于肿瘤标记物的诊断和检测。

图文导读

1.合成拉曼分子嵌入式金-银核壳结构（Au@Ra@AgNPs）纳米粒子

图1：Au@Ra@AgNPs）纳米粒子合成示意图

Au@Ra@AgNPs是在金纳米核上包裹拉曼分子层，再覆盖一层银包衣。具体如下，DTNB用作拉曼分子通过Au-S键结合到金纳米核上，形成一个自主装的分子单层（self-assembled monolayer,SAM），如图1所示。通过对苯二酚还原硝酸银可以形成银包衣层。本文中Au@DTNB@AgNPs纳米粒子的设计优势包括：1）金-银等离子体耦合效应能进一步增强SERS信号；2）将拉曼分子嵌入核-壳结构可以获得较为稳定的拉曼信号。

图2：使用不同比例的硝酸银和对苯二酚制备Au@DTNB@AgNPs

在合成过程中，随着硝酸银用量的增加，可以观察到溶液的颜色从紫色变成棕色，如图2所示，表明在Au@DTNB上包裹一层银包衣。当硝酸锌和对苯二酚的比例超过2:1时，纳米粒子容易聚集，导致多数纳米粒子不能有效地包裹上银包衣层。

2.Au@Ra@AgNPs的表征

本文使用UV-Vis光谱用来表征表金纳米粒子（AuNPs）和SERS纳米粒子（SERS nanotags）的表面等离子共振（SPR）。如图3所示，与AuNPs和AuNPs@DTNB相比，Au@DTNB@AgNPs的SPR峰随着硝酸银用量的不同而发生位移。AuNPs的SPR峰在540nm左右，AuNPs表面形成DTNB分子层后，由于表面折射率的不同，获得的Au@DTNB的SPR峰位移至550 nm。与对照组（制备Au@DTNB@AgNPs时加30µL硝酸银，不加对苯二酚）相比，当加入对苯二酚时，SPR峰蓝移，表明形成了银包衣层。当加入不同量的硝酸银时，SPR峰发生不同程度的位移，表明形成了不同厚度的银包衣层。当硝酸银与对苯二酚的比例为2:1时，SPR峰位移至525nm，表明形成了最薄的银包衣层。当硝酸银与对苯二酚的比例为2.5:1和3:1时，由于部分纳米粒子的聚集，SPR峰更宽（如图3中绿色和蓝色曲线所示）。

图3：AuNPs, AuNPs@DTNB和Au@DTNB@AgNPs的UV-Vis吸收峰

我们进一步使用TEM检测AuNPs、AuNPs@DTNB和Au@DTNB@AgNPs的尺寸，如图4所示，在TEM图像中，深色的AuNPs表面的浅色区域是银包衣层。当硝酸银与对苯二酚的比例是2:1时，银包衣层的厚度为5-7nm。随着硝酸银与对苯二酚的比例的增加，导致Au@DTNB@AgNPs的聚集以及较少的银包衣层形成。由于拉曼小分子DTNB包裹在核-壳结构中间，核-壳结构中的间隙小于1nm，以至在TEM图像中不能被观察到。

图4：加入不同量的硝酸银制备的Au@DTNB@AgNPs的TEM图

因此，本文通过UV-Vis光谱和TEM图像对Au@DTNB@AgNPs结构进行了表征。UV-Vis光谱表明银包衣层的形成，银的介电常数使得Au@DTNB@AgNPs的SPR峰蓝移。TEM图像显示了在较暗的AuNPs核周围形成了浅色的银分子层，进一步证明了Au@DTNB@AgNPs结构的形成

为了更好地阐明银包衣后SERS信号提高的物理机制，本文对纳米粒子的UV-Vis光谱、TEM图像和拉曼信号进行了考察。如图5所示，DTNB的特征拉曼峰位于1334和1560cm^-1，分别来自于NO₂的不对称伸展和芳香环的振动。在合成过程中，当硝酸银的用量增加时，拉曼信号增强，表明形成的银包衣层产生了较强的SPR效应，能够扩增DTNB的拉曼衍射。然而，当加入的硝酸银的量为75或90µL时拉曼信号，拉曼信号会显著提高，这可能时由于银包衣层厚度的增加或在合成过程中纳米粒子聚集体的形成。纳米粒子聚集体的形成会导致不同批次的纳米粒子具有显著的拉曼信号差异，而不能在定量分析中获得准确的结果。当硝酸银与对苯二酚的比例为2:1时，能获得最为均匀和最厚的银包衣，相应地获得最强的SERS效应，并且与UV-Vis光谱和SERS光谱。由于小分子的拉曼分子DTNB镶嵌在核-壳结构的中间，内部的核-壳之间的间隙约为1nm，产生的SERS增强效应在6.0*10⁵-5.0*10⁶。增强的SERS信号是由于核-壳内部间隙的局部的SPR效应增强了电磁场。

图5：不同量的硝酸银制备的Au@DTNB@AgNPs的SERS光谱图

本文进一步通过zeta电位对Au@DTNB@AgNPs的等离子稳定性进行考察。与AuNPs和Au@DTNB相比，当硝酸银与对苯二酚的比例为1.5:1时Au@DTNB@AgNPs的zeta电位的负值最大（表1），纳米粒子最为稳定。继续增加硝酸银的量时，zeta电位的负值渐低，Au@DTNB@AgNPs更不稳定，更容易聚集。TEM测定（图5）结果也表明，当硝酸银与对苯二酚的比例为2.5:1或更高时，Au@DTNB@AgNPs样品更容易聚集。

表1：制备的纳米粒子的zeta电位

纳米粒子的UV-Vis，SERS，TEM和Zeta电位结果表明，当硝酸银与对苯二酚的比例为2:1时，合成的Au@DTNB@AgNPs具有最厚的银包衣层，最为稳定，SPR效应也最强。

3.Au@DTNB@AgNPs的稳定性研究

本文使用UV-Vis光谱和拉曼光谱对的Au@DTNB@AgNPs（合成时硝酸银与对苯二酚的比例为2:1）的稳定性进行为期2周的考察，结果表明纳米粒子较为稳定，未出现显著的SERS信号改变或纳米粒子聚集，如表2所示。Au@DTNB@AgNPs的拉曼信号强度和UV-Vis吸收强度在2周内保持稳定，没有纳米粒子的聚集。

表2：使用UV-Vis光谱和拉曼光谱测定Au@DTNB@AgNPs纳米粒子的稳定性

4.Au@DTNB@AgNPs表面偶联抗体

纳米粒子的稳定性对于运输、储存以及用于准确定量至关重要。为了进一步的临床应用，对抗体偶联的Au@DTNB@AgNPs的稳定性进行考察。图2描述了以DTSSP作为连接体将anti-EpCAM抗体偶联在Au@DTNB@AgNPs表面的方法。与其他连接体（如MUA、EDC/NHS）相比，由于DTSSP含有的酯基可以与抗体的氨基反应形成肽键，含有的二硫键可以断裂并通过Ag-S键结合到Au@DTNB@AgNPs的表面，从而提供了更简单的方法将抗体偶联在纳米粒子上。

图6：将anti-EpCAM抗体偶联在Au@DTNB@AgNPs的表面

5.Anti-EpCAM偶联的Au@DTNB@AgNPs的稳定性

表3：通过UV-Vis光谱和拉曼光谱测定Anti-EpCAM偶联的Au@DTNB@AgNPs在不同缓冲液中的稳定性

本文对Anti-EpCAM偶联的Au@DTNB@AgNPs在4种不同的缓冲液中的稳定性进行了考察，通过UV-Vis光谱和拉曼光谱测定纳米粒子在哪种缓冲液中最稳定。表3结果显示Au@DTNB@AgNP在0.05%BSA（含0.1mMPBS）中UV-Vis吸收强度和拉曼信号强度无显著变化，表明纳米粒子在该缓冲液中最为稳定。相应地，当纳米粒子在溶液中聚集时，UV-Vis光谱和拉曼光谱信号值会发生显著变化。当溶液中不含PBS时，纳米粒子更易于聚集。对于进一步的临床应用，为了确保纳米粒子能用于准确的样品分析，需要使用对于纳米粒子更为稳定的缓冲液。值得注意的是，Au@DTNB@AgNPs由于银包衣层的毒性，而通常用于体外样品分析。通过使用生物相容性材料（如BSA、PEG）可以对纳米材料进行包衣用来提高其应用于体内样品分析的潜力。

6.结论

总体来说，我们通过较为优化的方法合成了拉曼分子镶嵌的核-壳结构Au@DTNB@AgNPs，由于核-壳结构中的表面等离子体耦合共振效应，SERS信号会显著提高，并且随着银包衣层的加厚获得更高的SERS信号，使其有望应用于临床。当硝酸银与对苯二酚的比例为2:1时制备的Au@DTNB@AgNPs最优，具有较高的SERS信号，优化的合成条件有望用于合成大量的纳米粒子用于临床诊断。UV-Vis光谱和拉曼光谱结果表明，Au@DTNB@AgNPs在两周内保持稳定。对Anti-EpCAM偶联的Au@DTNB@AgNPs在不同缓冲液中的稳定性进行考察，结果显示Au@DTNB@AgNP在0.05%BSA（含0.1mMPBS）中UV-Vis最为稳定，为SERS纳米粒子用于检测提供了稳定的缓冲液。

通讯作者简介

A/ProfYuling Wang

Yuling Wang is currently an Associate Professor in the Department of Molecular Sciences, Macquarie University in Sydney, Australia. She received her PhD from Chinese Academy of Sciences in 2009. She was then awarded an Alexander von Humboldt fellowship (2010) and the Individual Grant Fellowship from German Research Foundation (2012), working in University of Duisburg-Essen, Germany. In 2014, she received an Australian Research Council (ARC) Discovery Early Career Researcher Award (DECRA), worked in the University of Queensland (Australia). Towards the end of her ARC DECRA fellowship, she was appointed as a Senior Lecturer at Macquarie University in 2017 and was promoted to Associate Professor in 2020. She is also a Chief Investigator within ARC Center of Excellence for Nanoscale BioPhotonics and leads the SERS program forin vitrodiagnostics. Her research is mainly focused on plasmonic nanostructures for surface-enhanced Raman scattering/spectroscopy (SERS), biomarker sensing for point-of-care andin vitrodiagnostics, and personalized nanomedicine by using SERS.