前言

本文介绍的是深圳大学物理与光电工程学院邵永红教授课题组对基于非正弦调制的非线性扫描结构照明显微技术的理论模型研究，发表在《Journal of Innovative Optical Health Sciences》期刊2021年第5期。

ID-OCTA: Nonlinear scanning structured illumination microscopybased on nonsinusoidal modulation

ID-OCTA：基于非正弦调制的非线性扫描结构照明显微技术

Meiting Wang, Lei Wang, Xiaomin Zheng, Jie Zhou, Jiajie Chen, Youjun Zeng, Junle Qu, Yonghong Shao,and Bruce Zhi Gao

研究背景

超分辨显微技术（Super-resolution microscopy,SRM）实现了具有纳米级分辨率的生物成像，推动了传统光学显微技术的发展。特别的，结构光照明超分辨显微技术(Structured illumination microscopy,SIM)通过空间混频将对应样本结构细节的高频信息编码到基频信息中实现超分辨。然而传统的SIM仍受到光学衍射极限的限制，最多可将系统空间分辨率提高两倍。为了进一步提高SIM的分辨率，研究者们提出非线性SIM (Nonlinear SIM,NL-SIM)。NL-SIM技术利用高功率激发光或光转换蛋白使荧光饱和，引入额外数量的谐波，可使分辨率提高程度超过两倍。然而，这种方法不适用于活细胞成像，其成像所需的高功率激发光会带来严重的光毒性和光漂白性，进而损伤细胞。本研究中，我们通过将非线性调制与扫描双光子(Two-photon，2P)显微技术结合来避免高功率激发光的问题。

内容简介

在本项目中，我们提出了扫描双光子非线性结构光照明显微(2P-SIM)技术，利用非线性调制结构光激发样本，通过双光子效应产生荧光，荧光混频图像包含了高阶谐波，从而实现仅需低功率激发光的高分辨率成像。模拟结果显示2P-SIM技术可将2P显微技术的分辨率提高5倍。

图文导读

1.非正弦结构照明实现频移和多向频谱扩展

图1：非正弦结构照明实现频移和频谱扩展。（a）摩尔条纹现象。（b）光学系统可传递的物频谱，k₀代表系统通频带的截止频率。（c）非正弦结构光频谱包含五个频率分量。（d）物频谱与非正弦结构光频谱卷积后产生的频谱。（e）由于双光子倍频效应，获得的混频图像包含8个高频分量，重建图像后系统截止频率可扩展为k₀+4k_a。（f）多向频谱扩展。

如图1（b）所示，通常光学成像系统可探测到以k₀为半径的圆形区域内的频谱信息。SIM不改变这个可探测区域，而是通过混频原理将高频信息从该区域外部移动到内部，从而使系统能够探测到原本不能被传递的高频信息。如图1（c）所示，该非正弦结构光图案包含两种频率。使用该结构光激发样本，样本高频信息被混入系统通频带内（图1（d））。由于双光子倍频效应，被激发产生的荧光所包含的谐波数量进一步增加。图1（e）显示了一组空间频率模式，包括一个低频信息和八个高频信息分量。采集的混频图像包含了这九个分量，可通过后期重建算法将九个分量各自分离，并将相应分量移回其到样本频谱原本的位置。使用其他方向的结构光照明来重复该过程，可以在相应方向上扩展可探测频谱。图1(f)显示了多向频谱的扩展。

2.分辨率标定

图2：双光子显微成像（2P）、线性结构光显微成像（L-SIM）、正弦调制双光子结构光显微成像（2-NLSIM）和非正弦调制双光子结构光显微成像（4-NLSIM）的成像能力比较。(a)-(d)分别表示2P、L-SIM、2-NLSIM和4-NLSIM对理想点的模拟成像结果。(e)可观察的频谱区域。(f)不同成像方法对单个理想点成像的强度分布。比例尺，200 nm

为了标定4-NLSIM的分辨率，我们模拟了2P，L-SIM，2-NLSIM，4-NLSIM的成像过程。在模拟成像实验中，在随机位置生成理想点样本；样本分别被正弦和非正弦结构照明激发产生荧光，再通过光学系统后，由探测器记录混频后的荧光衍射图像，模拟结果如图2所示。与其他技术相比，4-NLSIM可重建出最小的光斑。根据荧光光斑沿中心黄线的强度分布，如图2(f)所示，4-NLSIM的半高全宽(FWHM)约为59nm，相比传统的2P技术提高了5倍，可探测的频谱区域得以扩展（图2（e））。

3.4-NLSIM分辨细节的能力

图3：不同的成像方法的分辨能力比较。(a)随机分布的理想点。(b)-(e)黄色框内两个理想点分别用2P，L-SIM，2-NLSIM，4-NLSIM成像的结果。(f)图(b)-(e)中光斑沿黄线的强度分布。比例尺为200 nm

图3证明了4-NLSIM分辨细节的能力。选择图3（a）中黄色框内的一对相邻点，并分别用2P、L-SIM、2-NLSIM和4-NLSIM对其成像，重建后的成像结果如图3（b）-（e）所示。光斑沿黄线的强度分布（如图3（f）所示）证明4-NLSIM能够分辨出两个接近的点，且其分辨能力在四种成像方法中为最佳。

综上所述，我们提出的这种基于点扫描的非正弦调制的2P-SIM方法，将SIM成像分辨率提高了5倍（FWHM=59 nm）。此外，高次谐波的产生可以简单地通过时间调制函数来控制，相比于饱和SIM，大大降低了对生物样品的光毒性和光损伤。最后，我们也建立了图像重建函数的理论模型，通过增加非正弦调制函数的频率，重构图像的分辨率可进一步的提高。

通讯作者简介

邵永红，深圳大学物理与光电工程学院教授，博士生导师。中国光学邵永红学会第二届生物医学光子学专业委员会委员。曾获深圳市自然科学二等奖，中国产学研合作创新奖（个人），江苏扬州绿扬金凤人才计划，第十五届中国国际高新技术成果交易会优秀产品奖，广东省科学技术三等奖，深圳大学优秀学者等荣誉。首次提出全固态的光谱-相位调制SPR成像技术，解决了相位调制SPR技术动态检测范围小的问题；首次提出扫描结构光超分辨显微技术，解决了非标记（SHG等）非线性光学超分辨显微成像难题。共发表SCI论文100余篇，授权专利20余项。主持国家重点研发计划子课题、国家重大科学仪器项目子项目、国家自然基金面上项目、中科院知识创新工程项目、广东省科技计划重点项目、深港创新圈项目等30余项。

陈嘉杰，深圳大学物理与光电工程学院, 助理教授，硕士生导师。致力于纳米光热镊、SPR传感、流式细胞成像技术的新方法、新现象、新结构的研究。具有深厚的光学成像设计以及微流控方面的经验和工作积累。共发表SCI论文20余篇，包括Optical letters, Advanced Optical Materials, Lab on a chip, Analytical Chemistry, Sensorsand Actuators B, Biosensors and Bioelectronics等，主持国家青年基金项目、广东省面上基金项目、深圳市高层次人才启动基金；参与国家重大科学仪器项目子项目、国家自然基金面上项目等。