华中科技大学武汉光电国家研究中心

骆清铭 龚 辉 李安安 袁 菁 李向宁

人的视觉不如鹰、嗅觉不如犬、爬树不如猴、奔跑不如豹，但人却成为“万物之灵”，这是因为人类拥有世界上最复杂最精密的物质结构，即具有思维功能的脑！

人脑的神经元（或称神经细胞）总数高达1000亿（1011），并且拥有众多不同的类型。神经元之间靠神经纤维（包括轴突和树突）联接形成信息传播的神经网络。轴突输出电脉冲信号，通过与另一个神经元树突形成的“突触”来传递；每个神经元可与数千个其他特定类型的神经元形成突触联结，从而形成“神经环路”，若干神经环路可组成神经网络。

脑功能与特定的脑区紧密相关，而脑高级功能的实现往往不是由一个脑区独立完成，需要多个区域协同合作。我们可以用地球比喻大脑，设想自己从天上俯瞰“地球”的结构和运作模式：具有各自使命和功能的北京、上海等城市，就代表着宏观水平的不同脑区和核团。北京、上海之间有着多条纵横交错的公路，脑区之间也有类似的长程联接神经环路或网络。神经环路或网络中还有数量更加庞大的局部联接，就好像各城市当地的房屋（一座房屋就如同一个神经元的胞体）之间被四通八达的路所连接。因此，明确脑内有多少种类型的神经元、获取脑内各种类型神经元的数目、解剖定位及神经元连接等信息，是准确解析神经结构的空间构成，进而建立脑连接图谱的关键。

以往生物学研究中，人们主要采用手工切片、每张脑片分别成像，抽样估算神经元的数目，再通过对照参考脑图谱，大致确定神经元和神经环路的解剖定位。这种做法不仅耗时费力，而且在认识三维脑空间内神经元真实复杂的形态结构上有着明显的缺陷。

针对脑连接图谱这一关键问题，美国和欧盟等脑计划都优先布局，哈佛大学、斯坦福大学等机构都有针对性地发展新技术、新方法，虽然取得了重要进展，但都还没有获得各项分辨率优于1微米、展示全脑完整的神经或血管连接的成像成果。我们团队自主研发了显微光学切片断层成像系统（Micro-optical Sectioning Tomography，MOST），实现了连续获取突起水平（亚微米分辨率）的完整脑数据，相关成果于2010年发表于Science期刊。在此基础上，我们团队又建立了荧光显微光学切片断层成像方法和技术（fluorescence Micro-optical Sectioning Tomography，fMOST），2013年发表于NeuroImage。为了能在单神经元水平解析及定位全脑的神经元，团队又发明了高通量双通道全脑成像的方法（dfMOST），可同时获取鼠脑内每一个神经元精细形态及相应的解剖学空间位置信息的全脑数据集，从而为解析脑提供一种全脑定位系统（Brain-wide Positioning System, BPS），该研究2016年发表于Nature Communications。

中国团队攻克美国脑计划所需技术

乙酰胆碱能神经元是脑内一群重要的调制类神经元，主要分布在基底前脑和脑干等多个脑区，通过其广泛分布的轴突纤维投射释放乙酰胆碱，调控皮层和皮层下核团的神经活动，参与运动、睡眠以及情感与记忆等重要功能。这类神经环路异常与老年痴呆、睡眠及认知障碍等多种神经系统疾病有关，相关机制的研究是医学与神经科学领域的热点。

图1 小鼠全脑的乙酰胆碱能神经元图谱

（A）切片成像示意图；（B）全脑三维分布；（C）主要分布的21个脑区内定量计数；（D）50个基底前脑乙酰胆碱能神经元的完整形态；（E）基于神经元投射连接的分类结果；（F）相邻神经元具有不同的投射模式

2017年《美国科学院院报》在线发表了我们团队与中科院神经所仇子龙课题组、美国艾伦脑研究所Hongkui Zeng的合作成果（见图1），在单神经元水平解析了乙酰胆碱能神经元在全脑定位分布和基底前脑内的精细形态结构。利用dfMOST全脑精准成像技术（见图1A）结合荧光蛋白特异性标记的小鼠模型及病毒标记技术，我们获取了世界上第一套完整的乙酰胆碱能神经元三维全脑分布图谱，该图谱包括了小鼠乙酰胆碱能神经元在全脑的高分辨率分布数据集（见图1B）、21个主要分布脑区的定量信息（见图1C），为乙酰胆碱能神经元的功能研究提供了解剖学参考。

在此基础上，这项研究还重建了小鼠基底前脑50个乙酰胆碱能神经元的完整形态（见图1D），结合遗传标记、连接组和形态学参数进行了神经元分类（见图1E），并通过分析这些神经元的投射脑区，提出了单个神经元与下游脑区的新连接模型，即单个神经元的轴突分支倾向于共投射到具有相互连接关系的下游脑区，且相邻的乙酰胆碱能神经元可连接完全不同的下游环路（见图1F）。该研究为理解乙酰胆碱能神经元如何调控神经活动提供了新的参考，也为划分神经元亚类提供了新的启示。

审稿人有这么一句评价：“这种技术正是美国脑计划所需要的！”

打造脑血管基础研究的“辞典”

脑是血管极为丰富的器官，全身总耗氧量的四分之一都用来维持神经的活动。有研究表明，如果阻断血管的血液供应，几秒后神经元就会停止发放动作电位，几分钟就会导致永久性的神经损伤。

脑血管的形态特点是迂曲易变，血管之间通常互相交错，所以需要三维的图像才能展现复杂的血管解剖关系。在生物医学领域广泛应用的CT和MRI等三维影像技术由于分辨率较低，无法分辨直径仅为数微米的毛细血管。近些年发展的三维光学显微成像技术，虽然能分辨毛细血管，但受限于光的散射和吸收，成像深度有限，其研究仍然局限在局部脑皮层区域。

2017年《神经解剖学前沿》在线发表了我们团队有关脑血管图谱的研究成果。该研究以MOST成像技术获取的五套尼氏染色小鼠全脑数据集为基础（体素分辨均为0.35μm×0.35μm×1μm，每个鼠脑采集了一万张冠状面，五个鼠脑

总数据量是10TB），首次在全脑范围内系统性构建和标识出包含动脉、静脉、微动脉和微静脉的精细脑血管图谱。研究不仅对完整血管树进行了三维重建，而且利用同一鼠脑的细胞构筑图像提供的解剖结构信息，在单细胞水平实现了血管分支起点的立体定位。借助高分辨的血管重建数据，发现了许多之前未曾报道的静脉分支，并按通行的命名规则进行了命名。此外，进一步定量分析了动脉、静脉血管与脑区的连通性及供血关系，有助于直观了解动脉血是经过哪些血管分支输送到了特定脑区/核团，供能后的静脉血又是如何被收集、汇聚。该图谱将为脑功能和脑疾病的研究提供重要的基础性资源数据库。

国际同行评价：这个工作是类似于打造“辞典”一样具有非常重要意义的基础性研究，为脑血管领域提供了一份难能可贵的、可以纵观全局的参考文献，尤其是对静脉分布的研究（见图2），“这是一个基础性的工作，为后续脑功能和脑疾病的研究提供了一个必须的、也非常及时的图谱”。

图2 小鼠全脑静脉血管的树形结构图。黑色和蓝色分别为曾在小鼠和大鼠研究中已报道过

的分支，红色为新发现的分支。

正如习近平总书记在全国“科技三会”报告中指出：“脑连接图谱研究是认知脑功能并进而探讨意识本质的科学前沿，这方面探索不仅有重要科学意义，而且对脑疾病防治、智能技术发展也具有引导作用。”

未来的发展方向是从获得小鼠全脑图谱，再到非人灵长类全脑图谱，最终获得人类全脑图谱。

三维可视化的高分辨全脑神经和血管图谱，将使人们能够对脑中感兴趣的对象在三维空间中以任意角度、任意剖面观察脑内复杂空间关系，有助于为类脑系统和通用智能的研究提供全新的思路和颠覆性的新概念，将对脑认知、脑健康、类脑智能的发展产生重大的影响。