研究背景

组织光透明技术通过调控生物组织折射率均一化提升光学成像深度，为完整器官的三维可视化提供了重要工具。尽管该技术在啮齿类小动物模型中已获得广泛应用，但向大型动物（如猪、非人灵长类）的迁移，面临组织尺寸的量级跃升，以及物种组分差异带来的"尺度可比而方法不兼容"的核心挑战，严重制约其在转化医学研究中的潜在应用。

文章简介

本综述系统阐述了组织光透明技术的原理，剖析了大型动物与啮齿类在组织学特征上的差异对技术迁移的影响，梳理了其在中枢神经、感觉器官等多个系统中的代表性应用，并展望了未来发展方向。

图文简介

1.组织光透明的基本原理与方法体系

组织的不透明性主要源于其结构的异质性和各组分间的折射率不匹配。组织光透明主要通过去除或替换强散射成分，再引入折射率匹配介质，或者改变组织微结构降低散射截面，来实现组织透明化；同时去除光吸收成分会进一步降低光在组织中的衰减，提升光在组织中的穿透深度。如图1所示，组织光透明方法可分为三大类：基于有机溶剂的透明方法，通过脱水和脱脂实现快速透明，但易导致荧光淬灭；基于水溶性试剂的方法，大多能更好地保留荧光信号，但处理周期相对较长；基于水凝胶包埋的透明方法，通过化学交联保持组织结构完整性，却增加了操作流程的复杂性。这三类方法体系的形成为后续技术的迭代优化提供了多元的技术基础。

图1组织光透明技术的原理和分类。a 组织光透明主要通过去除光散射和光吸收成分，然后使用专用介质进行折射率匹配来实现的。脑切片图来自© Wikimedia。b 三种主要光透明方法体系工作流程的比较：基于有机溶剂的方法、基于水溶性试剂的方法和基于凝胶包埋的方法。

2.大型动物组织特性带来的独特挑战与现有解决方案

大型动物与啮齿类在组织结构和成分上的差异，构成了传统透明方法迁移应用的主要障碍。具体挑战主要体现在三个方面：其一，组织成分差异显著，如图2所示，非人灵长类和猪的大脑具有更高的白质比例（约39%-45%），伴随更致密的髓鞘结构、更高的组织刚度和更复杂的血管网络，其实质器官也表现出更高的细胞外基质密度和独特的脂质组成。其二，组织空间异质性大，大型器官内部不同区域的密度和成分差异导致试剂渗透不均衡，常出现周边过处理而核心区域透明不足的现象。其三，标准化透明体系缺位，目前缺乏针对大型动物组织透明参数的系统性评估标准。为应对这些挑战，研究者已做出了不少努力，例如：SHANEL方法利用小胶束两性离子去污剂CHAPS实现全人脑的透明，PuClear方法基于CLARITY和CUBIC方法，利用Triton X-100透膜联合高折射率匹配液，在保持组织形态的同时实现厚猕猴脑切片的均匀透明度，以及ScaleSF方法提供的耐戊二醛处理方案，能够在啮齿动物和灵长类动物中实现多尺度光学和电子显微镜集成成像。

图2 大型模式动物（猪、猴）、小鼠和人类的结构差异。a大型模式动物、小鼠和人类全脑体积的比较 [Protein & Cell 13(10), 707–720 (2022)]。b与小鼠和人类相比，大型模式动物大脑中髓鞘形成模式和白质含量的变化。鼠：来自rainmaps.org（加州大学戴维斯分校）。猪：来自[eNeuro 5(5), ENEURO. 0102-18 (2018)]。猴子和人类：来自brainmuseum.org（UW-MSU/NMHM），由NSF/NIH支持。c猪和小鼠心脏组织的组织密度差异[Front. Bioeng. Biotechnol. Conference Abstract: 10th World Biomaterials Congress. 142 (2016)]。d猪和小鼠肝组织的结构和形态差异 [Malar. J. 12(1), 430 (2013), Mol. Ther. 17(3), 491–499 (2009)]

3.跨器官系统的应用进展

组织光透明技术已在大型模式动物多系统中取得显著成果。在中枢神经系统的应用尤为深入，例如：PuClear技术完成猕猴全脑的高通量三维重建，揭示了精细尺度的丘脑-皮质的投射模式；优化的iDISCO方法首次解析了绵羊下丘脑KNDy神经元构筑；CUBIC-HistoVIsion技术实现了绒猴脑半球星形胶质细胞和血管的高均匀性标记，为胶质细胞研究建立了可靠范式；SHIELD与eFLASH技术的联用解析了绒猴视觉皮层中PV+和NPV+神经元的层状分布特征。在感觉器官研究方面，优化的BoneClear技术实现了完整非洲绿猴耳蜗的毛细胞和螺旋神经节神经元的高分辨率3D成像；基于CUBIC的透明方案结合过氧化氢漂白，首次实现了完整雪貂眼球的透明化。在呼吸循环系统研究中，iDISCO和CUBIC联合方案精确定位了猕猴淋巴结内疫苗成分；优化的Visikol®组织透明方案，结合免疫荧光标记定量分析了非人类灵长类胎盘微血管网络；ECi透明方法可视化了雪貂呼吸道SARS-CoV-2感染的离体病理特征。在内分泌代谢系统研究中，3DISCO结合光片显微镜实现了肥胖猪模型脂肪组织的三维定量分析；SHANEL技术成功绘制了转基因猪的胰腺β细胞空间分布的可视化；Visikol®组织透明清晰呈现了猕猴骨髓中造血干细胞与脂肪组织的三维空间关系。

4.展望

组织光透明技术在大型动物研究中的未来发展需要在以下几个方面取得突破：其一是样品预处理方案，针对更大的组织样本，需要根据组织反应特征动态调整试剂浓度和处理时间，采用分段式、渐进式的处理方法，有望产生更好的透明结果并兼顾组织结构完整性。其二是试剂渗透效率，需要筛选更高效透明试剂，运用电场、灌注、超声等多模式物理促渗策略，进一步加速多种化学分子在组织内的渗透，提高光透明的效率。其三是跨物种兼容方案，亟需构建包含组织器官尺寸、脂质组成等关键参数的物种特异性数据库，设计模块化、标准化的试剂处理单元，建立具有实时监测能力的自适应控制技术和包含定量评估指标的标准化多物种验证平台。

组织光透明技术在大型动物研究中的深入应用，亟待构建一个融合多技术协同的系统性优化框架。其中，标记技术的突破尤为关键，当前方法在厘米级样本深层组织的抗体渗透不足，且标记效率随深度增加迅速下降。未来，大体积样本的标记可整合三大策略：分子工程层面，开发具有两性离子修饰的纳米抗体片段；物理增强层面，融合电场辅助和超声微泡技术实现抗体的高效递送；化学生物学层面，结合级联放大标记系统和基于代谢前体的点击化学反应解决深层信号衰减问题。与此同时，持续推进光片照明显微镜等成像技术的创新，通过改进光学系统支持更大尺度的全面成像，整合高速扫描与自适应采样技术提升通量，并引入深度学习算法等优化海量三维数据的智能分割和定量分析。

总结

组织光透明技术为大型动物的三维成像提供了新的手段，但其在相关领域的深入应用仍面临物种差异带来的方法学挑战。破解这一难题，需要系统性优化化学试剂配方、创新物理促渗策略、建立标准化评估体系，并结合不断进步的标记、成像和数据分析方法。这些举措将充分释放组织光透明技术在大型动物研究中的潜力，为解析复杂生物系统与加速转化医学提供更有力支撑。