本文介绍的是中科院苏州医工所巩岩研究员课题组在基于非对称三光束干涉的三维结构光照明显微镜领域的研究成果，发表在《Journal of Innovative Optical Health Sciences》期刊2021年第2期。

ID-OCTA:Structured illumination microscopy based onasymmetric three-beam interference

ID-OCTA：基于非对称三光束干涉的结构光照明显微镜

Linyu Xu, Yanwei Zhang, Song Lang, Hongwei Wang,Huijie Hu, Jingkai Wang and Yan Gong

研究背景

细胞形态学、微生物学、神经生物学等多种生物医学领域的发展依赖于现代显微成像技术的进步。大多数亚细胞功能器官的尺寸都处于百十纳米尺度，因此该尺度下生物体三维形态与动态变化的研究对于生物医学研究至关重要。但是光学衍射极限的存在，限制了传统光学显微技术的成像分辨率。虽然研究者利用电子显微镜可以突破衍射极限达到很高的成像分辨率，但是其在三维成像和成像时间分辨率方面能力有限，不能满足细胞运动、囊泡融合、脂类代谢等多种研究领域的成像需求。因此，人们对可获得更高时空分辨率和轴向分辨率的光学超分辨显微技术期待颇深。

结构光照明显微镜(SIM),光机系统简单，成像速度快，观测视场大，已广泛应用于生物学研究。但是传统的三维结构光照明显微镜采用三光束干涉照明，重构N层三维超分辨图像就需要采集15ÍN幅原始图像,而且传统的SIM系统中的偏振调制方法都存在着环境稳定性差、调制速度慢、能量损失大等问题，都限制着SIM系统在更多的三维成像领域的应用。

内容简介

结构光照明显微镜(SIM)通过具有特定空间分布的照明光（如正弦条纹光）激发样品荧光，将显微系统原本不能探测到的高频信息转移到可被探测的低频区域，再通过后期算法处理恢复高频信息，重构出超分辨图像。本文提出了一种基于非对称三光束干涉的快速、灵敏的三维结构光照明显微系统，将分段半波片作为一种线偏振调制方法首次应用于三维SIM系统。系统中采用了一种新颖的时间序列采集方法，将获取每幅原始图像所需的时间减少了一半，虽然重构一幅超分辨率图像需要采集21幅原始图像，但与传统的SLM-SIM相比，本文提出的SIM系统对每幅超分辨率图像的成像速度提高了30%。本文阐述了相关的理论推导、硬件系统和验证实验。

图文导读

1.基于非对称三光束干涉的结构光照明显微技术理论推导

图1：非对称三光束干涉三维SIM频谱拓展示意图

对于光学三维显微镜系统，传统光学系统OTF如图1(a)所示。非对称三光束干涉照明方法的频谱分布由推导得出的公式（1）可知，在X轴方向有七个空间频率分量，在Z轴方向有一个空间频率分量。图1（b）、（c）、（d）表示了m±1、±3和±4时在三维频域中的样本信息分布，图1（e）表示了基于非对称三光束干涉照明超分辨成像的所有频率分量叠加构成了最终的三维超分辨图像。即采集的每幅原始图像的频域信息都是由各个组分的空间频率分量的总和。从图1（e）与图1（a）相比，证明本文提出的非对称三光束干涉SIM技术确实实现了横向与轴向上的频域拓展。此外，图1（f）为传统三光束干涉超分辨显微技术的频谱拓展图，图1（e）和图1（f）相比可以看出，非对称三光束干涉超分辨显微技术与传统SIM相比可以达到同样的横向分辨率和仅略低一些的轴向分辨率。

2.分段半波片

图2：分段半波片偏振调制原理图。（a）入射光束的偏振方向。（b） 分段半波片快轴方向。（c）经调制后出射光束的偏振方向

本文提出了一种使用分段半波片（Segmented Half-Wave Plate——SHWP）进行偏振调制的方法，由6个等分的扇形二分之一波片组成。此方法可以覆盖可见光范围内的所有激发波长，无能量损失，无时间延迟。同时，由于0级衍射光斑无法经过分段半波片，此偏振调制方法无法使用传统三光束干涉进行3D超分辨成像，却可以匹配本文提出的非对称干涉照明3D超分辨成像的方法。本新型偏振调制方法已经申请了国家发明专利，已获授权。

3.快速采集时序

图3：传统SIM采集时序与本文提出的采集方法时序。（a）传统SIM采集时序。（b）本文提出的采集方法时序

当空间光调制器（SLM）产生任意条纹时，不可避免地要连续加载两幅相位差为π的二值条纹图像（A+和A-）。传统的3D-SIM采集每幅原始图像，只能利用其中一幅条纹图A+或A-，浪费了另一幅条纹图的显示时间。在本系统中，当相位改变±π，干涉条纹不会发生变化。因此，SLM加载的条纹图像A+和A-可以用来产生相同的照明条纹。本文利用这一特点，设计了一种独特的快速捕获方法。

如图5所示，假设需要采集四幅原始图像，采集每幅原始图像的曝光时间为10ms，我们在系统中采用的传统时序采集方法和新的快速采集方法分别如图3（a）和图3（b）所示。可以看出，新的采集方法可以将每幅原始图像的采集时间减少一半。

4.基于非对称三光束干涉的结构光照明显微系统（ATI-SIM）

图4：基于非对称三光束干涉的结构光照明显微系统简图

5.小鼠视网膜成像

图5：小鼠肾组织高尔基体的三维成像效果。（a） xy平面的ATI-SIM超分辨图像；（b）xy平面的宽场图像；（c）xz平面的ATI-SIM超分辨图像；（d）xz平面的宽场图像。

用本文所述系统对小鼠肾脏切片中的高尔基体进行三维成像。采用60X/1.49NA油浸物镜和488 nm激光激发。原始数据沿Z轴采集了30层图像，步长为100 nm。图5（a）和（b）分别是ATI-SIM和宽场显微镜拍摄的第17层的xy平面成像效果图，而图5（c）和（d）分别是ATI-SIM和宽场显微镜拍摄的第17层的xz平面成像效果图。结果表明，ATI-SIM比传统的宽场显微镜具有更高的横向和轴向分辨率，并且确实能够抑制离焦模糊。

通讯作者简介

巩岩，中国科学院苏州生物医学工程技术研究所二级研究员，博士生导师，中科院苏州医工所副总工程师。研究方向：光学系统集成设计、超/高显微计算光学成像技术。曾主持科技部“十二五”国家重大专线“02”专项课题、国家基金重点项目和多项面上项目“863”项目、中科院重大装备研制项目和“中国——白俄罗斯”国际合作项目等研究工作。获2002年吉林省第七届青年科技奖提名；获2000年军队科技进步一等奖一项。江苏省“双创人才”，国务院政府特殊津贴获得者。发表学术论文100余篇，申请发明专利50余项，获授权发明专利24项。